商業模式的保護精選(五篇)

序言：作為思想的載體和知識的探索者，寫作是一種獨特的藝術，我們為您準備了不同風格的5篇商業模式的保護，期待它們能激發您的靈感。

篇1

[關鍵詞] 會展 知識產權 商業模式

知識經濟與互聯網時代到來至今，形成了多種嶄新的業態，會展商業模式創新也成為會展業不斷發展必不可少的原發動力。要使這種創新源源流長、要讓創造者積極所為，必須對該類創新實行制度性保護，對侵權人形成威懾性約束，對侵占他人權利行為實施懲罰性制裁。但目前，我國對會展商業模式保護的關注和研究尚未有效展開。

一、會展業知識產權保護歷程

作為現代服務業范疇的會展行業,其知識產權保護最早可以追溯到1873年的“維也納國際發明展”。當時,展會舉辦國奧地利制定了一項特殊法律,向展會展出的各國發明、商標和外觀設計提供特殊的臨時保護。會展行業知識產權保護由此起步。

歷史的腳步走到了21世紀門檻邊,全球會展行業早已織就了較為完整的知識產權保護網,商標、技術發明、外觀設計、新型應用等一應俱全。但也就在此時,隨著計算機和網絡技術的廣泛應用,實踐中出現了除已經被完善保護的傳統知識產權形態外的樣式繁多的會展商業模式。就是這類集人類智慧、借助現代技術手段實現的創新活動,卻因其遲到,被拒在了已有的知識產權保護網之外。

為了保證并促進對各國經濟繁榮起到積極推動作用的會展業的發展,面對出現的問題,各國相關學界、政府部門和企業,逐步投入到了會展行業商業模式保護的研究和實踐之中,領頭的自然還是發達工業國。

二、商業模式及會展商業模式保護現狀

1.發達國家的研究與實踐

(1)美國專利商標局(USPTO)于2000年3月公布了一項應對商業模式專利的行動計劃。該計劃的內容主要包括:修訂商業模式發明專利的審查標準，擴大對美國“專利分類705”申請案件的檢索范圍，加強專利審查員的培訓，以及保證對商業模式專利申請進行適格性、新穎性和非顯而易見性的實質審查。USPTO還在2000年7月公布的商業模式專利白皮書中對商業模式專利的演變、“專利分類705”，以及專利審查員的培訓方式做出了詳細的說明，旨在進一步規范該類專利審查的標準。此外，USPTO還創建了“技術中心2100”，專門審理“專利分類705”類目中的申請。統計數字表明，第705類專利在1999年之后急劇上升，從1995年申請數的170件猛增到2000年的7800件，2001年達到1萬件。經過幾年的實踐，在“陽光下一切人類的發明創造均可獲得專利”的呼聲中，商業模式在美國獲得專利保護已不是問題，美國專利商標局和法學家們現在研究并更為關注的是，如何使該類專利審查制度穩定并規范。

(2)歐盟專利局曾一度將商業模式排除在專利保護之外。根據《歐洲專利公約》第52條規定，科學原理、數學方法、實施心理活動游戲或商業模式的技術、規則、方案,以及計算機程序、信息的表達是不可授予專利的。但隨著美國率先認可了商業模式可以成為專利法保護的客體后，為了在國際知識產權的競爭中取得優勢地位，歐洲專利局的態度也開始傾向于承認商業模式的可專利性。2001年11月歐洲專利局了新的專利審查指南，確認了其在計算機軟件和商業模式上的擴大保護政策。根據該審查指南，商業模式的可專利性已不容置疑。歐洲專利局在處理一項商業模式專利的申請中，更加注重對其創造性和技術特征的判斷，而非僅僅審查其是否屬于商業模式本身。在經過了長期的、多方的辯論之后，歐洲的態度已由對商業模式專利的強烈反對轉變為不再抵制，即商業模式可以通過“技術包裝”而獲得專利法的保護。

(3)日本在對待商業模式專利的問題上采取了實用主義的策略和主張。2000年日本特許廳修訂了《專利審查指南》，增加了與商業模式有關的發明創造的實施例，對利用網絡或計算機的商業模式不再被視為抽象的概念，可以在日本獲得專利法的保護。此后，日本又于2002年修改了本國的《發明專利法》；2003年，日本知識產權戰略本部又公布了“知識產權戰略推進計劃”，充分表明了其積極提升本國知識產權競爭力的態度和決心。

2.國內研究與實踐

(1)會展實踐方面。針對國內會展商業模式的表現形式,已有不少公開報道。如上海世博會標志特許經營的運營模式;第二屆中國(深圳)國際科學生活博覽會結合全國性的活動和互聯網及媒體的資源，確立了三大平臺互動的全新展會運營模式;慧聰網水工業產品采購交易會和慧聰網泵閥產品采購交易會將傳統貿易展覽會和電子商務有機結合,形成“采購交易會＋電子商務平臺”――線上線下互動模式等等。此外,國內還有對諸如基于會展會后服務的商業模式、商業會展市場推廣的整合模式、市場化運作展會模式等都進行過報道。

(2)司法實踐方面。2000年3月，上海卓尚信息有限公司告e龍網信息技術北京有限公司“網上商業模式侵權案”，出現了號稱“中國網上商業模式保護第一案”；2007年5月，北京首都在線網絡技術有限公司提出“網絡桌面媒體”商業模式的專利申請，出現了我國“商業模式保護”專利申請第一案。

(3)法規方面。2004年10月1日國家知識產權局于新頒布了《商業模式相關發明專利申請的審查規則(試行)》;2006年5月30日,國家版權局、信產部頒發的《互聯網著作權行政保護辦法》開始實行等。

另據國家知識產權局新聞發言人2007年介紹：從2006年開始，中國《專利法》進行第三次修改，送審稿當年年底已正式提交國務院審議。又據國家保護知識產權工作組辦公室主任、商務部副部長在2007年介紹：“2007年政府部門在加強對知識產權的司法保護方面一個顯著的特點就是，要進一步根據《專利法》修改情況研究制定涉及侵犯專利權認定標準的司法解釋；通過對知識產權行政案件司法審查的范圍、標準、程序、裁判方式等問題的調研，推動出臺司法解釋?！?/p>

3.結論

(1)對“商業模式”作為知識產權的一種類型進行保護已形成共識。從上述內容可以看到,以美、歐、日為代表的發達工業國對商業模式保護在本世紀初就從研究、立法、實施等各層面全面展開,我國也已在2004年頒布了相應的審查規則。

(2)保護方式多采用專利保護形式。知識產權保護方式通常為著作權保護、商標保護、專利法保護和反不正當競爭等。歸納國內外已有的實踐和研究,對商業模式的保護主要采用專利保護法。

(3)會展行業商業模式保護尚未涉及。一方面,會展行業知識產權保護目前仍局限于商標、技術發明、外觀設計、新型應用等傳統領域,而對其商業模式保護國外也剛剛起步,國內未曾涉足。另一方面,現有商業模式保護的成功案例,無論國內還是國外,都集中在電子商務、網絡游戲、金融和商業行業,在會展行業基本沒有實踐和研究。

三、會展商業模式保護的重要性與緊迫性

1.會展業的健康發展對上海的經濟發展具有重要意義

上海市委書記在近期的市委常委會上指出：“上海轉變經濟發展方式迫在眉睫，現代服務業的發展決定上海未來?！鄙虾＝鼛啄曛铝τ诎l展的和發展最快的是現代服務業，2006年GDP比重已經超過全市的50%，而會展業則是其中重要的一塊，其增長速度在最近的10年每年超過20%，而且還在緊鑼密鼓籌辦世博會。

2.會展業的健康發展需要更加完善的知識產權保護

上海把現代服務業中的會展業作為重點發展點，而且作為2010年世博會的舉辦地，上海自覺不自覺、愿意不愿意都已成為世界會展領域的矚目地，也必將成為會展行業知識產權保護的中心舞臺。面對行業內出現的知識產權保護的新內容、新問題，如何提升國內會展行業知識產權保護水平？是否需要對會展商業模式實行保護？怎樣有效實現對會展商業模式的保護？如何與國際接軌、是模仿還是創新？世博會期間站在世界會展舞臺中心的上海，在知識產權保護方面應該以什么樣的形象出現？怎樣體現希望的形象？……這些都是值得研究，而且是即待研究。

3.會展商業模式保護的完善，有利于整體創新環境優化

總書記2008年6月23日在“兩院院士大會”上指出：“轉變發展方式、實現經濟社會又好又快發展，迫切需要我們加緊建設創新型國家”；“建設創新型國家，這是國家發展戰略的核心”；“自主創新能力是國家競爭力的核心”。

會展商業模式創新和保護是知識產權保護的新領域，會展業又是現代服務業的重要組成部分，是上海經濟轉型發展的方向之一。開展會展商業模式保護研究，不但有利于知識產權保護水平的提高，也有利于創新城市乃至創新型國家的建設。

參考文獻：

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篇2

關鍵詞：互聯網保險 商業模式 發展策略

課題：

1、高職保險專業群人才培養模式研究 湖南省十二五教育規劃課題，編號：XJK012CZJ104。

2、湖南經濟發展中的保險支撐機制與實證研究――以服務“四化兩型”建設為視角 編號：14C0004。

互聯網保險是普惠保險（Inclusive insurance）中的一種新興業態，在2013年，眾安在線宣布網絡險企，互聯網保險成為名極一時的財經新聞。根據相關研究資料顯示，在2012～2013年，經營互聯網保險業務的主體從32家上升到63家；互聯網保險保費收入從35.12億元上升到301.02億元；投?？蛻魯祻?23.51萬人增長到5632.54萬人。從上述數據不難看出，互聯網保險在我國的增長態勢可喜?；ヂ摼W對我國保險業帶來深遠而又持久的影響，發展互聯網保險成為我國保險行業發展的必然選擇。為了能夠規范互聯網保險市場和保護消費者的合法權益，互聯網保險應該注重以下幾個方面：注重產品創新；注重線上和線下的結合；開展大數據分析；注重創新商業模式。

一、互聯網保險

目前來看，對互聯網保險沒有形成一個統一的定義。根據保險協會對互聯網保險的定義不發現，互聯網保險主要指的是保險中介機構通過互聯網為客戶提供相關服務信息，實現以下幾種業務：投保；承保；核保；保全；理賠等。互聯網保險完成的在線服務和在線銷售等功能，通過第三方機構實現電子支付等經營管理活動?；ヂ摼W保險不僅僅是對傳統保險商業模式的改革，而且還 是一種新的銷售渠道。不管如何定義互聯網，均需要從以下幾個角度出發：

一是互聯網保險產品。首先，以互聯網作為保險業的銷售渠道之后，保險企業應該要以客戶為中心，開發適合互聯網的保險產品；其次，隨著互聯網行業的不斷發展，保險作為管理的有效手段，保險企業應該充分觀察到潛在風險，開發互聯網經濟風險的保險產品，發揮出保險為社會經濟發展的保護功能；

二是使用互聯網技術和互聯網思維經營管理保險企業。保險企業需要在互聯網思維背景下制定相關經營戰略，建立全新的經營體系，將開放和協作等互聯網精神貫穿于保險經營管理的全過程中，為客戶提供更為滿意的服務；

三是在線經營保險業務。在線經營保險業務將保險產品信息展示和理賠等業務工作在網上去完成，代替傳統電話服務和紙質服務；

四是在線銷售保險產品。要想促進保險銷售模式的多樣化，必須 從傳統的渠道上逐漸往互聯網方向發展，積極借助新的技術和新的渠道，抓住時展的契機。

二、互聯網保險發展中遇到的基本問題

（一）線上與線下結合比較弱

現階段來看，互聯網保險僅僅限于簡單的保險品種，一些較為復雜的保險品種，如護理保險和人壽保險等需要保險工作人員進行推銷和說明，一些金額比較大的理賠案例需要現場查勘?；ヂ摼W無法完全代替人工服務，國內保險行業產品基本上都圍繞著組織架構而建立，因此使得傳統的保險公司很難從組織結構層面上做好互聯網保險工作。

（二）創新保險產品不多

互聯網保險銷售目前以傳統保險產品為主，創新型的 保險產品不夠多。與此同時，互聯網保險銷售受地區經濟發展水平的影響比較深刻，地區經濟發達水平高低直接影響著保險工作人員是否能夠深度發掘消費者 所需要的相關保險產品，最終 使得保險業務能夠精確到每一位客戶。

（三）創新商業模式比較薄弱

現階段來看 ，保險企業主要是將互聯網作為一種銷售渠道，一旦沒有利用好互聯網模式，勢必會改變保險業務的運作模式，最終改變整個保險行業的價值體系。保險參與者沒有有效實現互聯網平臺的交流與溝通等，保險公司僅僅通過服務化和精英化方式來完成保險融合。

三、互聯網保險的商業模式

（一）移動互聯網銷售模式

移動互聯網銷售模式主要利用的是手機 和平板電腦等設備提供相關服務。以國華人壽為代表的保險公司推出了微信公眾服務憑條，相比起傳統的銷售渠道而言，移動互聯網保險具有更貼近客戶基本需求的優勢；

（二）專業互聯網保險企業模式

專業互聯網保險企業通過專門設立的互聯網保險企業來經營相關保險業務，我國太平洋保險和人壽保險等公司紛紛成立了電子商務公司，繼而經營好互聯網保險業務工作。即使專業互聯網保險公司模式得到社會的關注，但是由于受到能力條件有限因素影響， 線上成交的運營模式在不斷地嘗試和探索中；

（三）官方網站模式

官方網站體現了網站主辦者的意志，具有權威作用?；ヂ摼W保險的官方網站模式主要指的是保險企業來展現保險產品信息，提供在線服務工作。一些頗有實力的保險企業更為注重品牌效應，為具有品牌忠誠度的客戶提供網上購買的渠道，對產品的介紹也更為細致，用戶也能夠選擇到更適合自己的保險產品。官方網站模式具有以下幾個方面的特點：其一，有利于在公眾面前樹立良好的企業形象；其二，有利于降低對第三方網站平臺的依賴；其三，有利于保險企業的自身品牌推廣。

參考文獻：

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篇3

[關鍵詞] 計算機軟件 源代碼 專利 著作權法與商業秘密法結合保護

一、軟件源代碼的技術特征和商業運作機制

軟件是指揮計算機解決某問題而編寫的程序及相關文檔的總稱。計算機程序通常包括源程序和目標程序,又稱源代碼和目標代碼。源代碼是由開發者使用類似于自然語言和數學公式的高級語言或匯編語言,如C、Java、Basic、Fortran等編寫而成,可供技術人員閱讀、修改。而目標代碼則是通過開發工具包將源代碼直接編譯,以0或1的二進制編碼形式表示,能直接由計算機識別,操作并實現某項功能的程序。

從軟件行業的技術特征來看,計算機程序開發的過程,首先從開發人員的技術思想開始,而這種新的技術思想、結構又需要,而且只能通過源代碼的編寫來實現。開發人員通常必須首先分析用戶的實際需要和技術要求,明確此項軟件最終應當實現的功能和用途,然后運用自己的專業技術知識,設計算法、確定結構,選擇一種或幾種最優或最適合的高級程序設計語言。接著,利用該語言的開發工具包所提供的語言環境和語法格式編制源代碼,再利用工具包中自帶的翻譯程序將已經編碼的源程序翻譯成目標代碼,由計算機自動識別和運行。初次試運行結束后,開發人員根據運行的實際結果對源代碼進行進一步的修改和完善。如果初次運行失敗,開發人員則需要使用調試功能查找問題,修改源代碼,再次投入翻譯和運行。一個新程序開發成功往往需要多次試運行并修改,直至得到最佳程序方案,方能將目標代碼及用戶手冊提交用戶,投入使用。當然,這其中也包含有軟件開發失敗,程序預期功能最終未能實現的風險。由此可見,軟件開發最關鍵的技術核心,在于確定技術方案,編制源代碼階段。源代碼具有可操作性、間接應用性,直接反映了開發者的思想和結構設計,決定了軟件的技術含量和智力水平。

從軟件行業的商業運作機制來看,由于軟件從根本上說,僅僅是一種蘊含著技術思想的工具,根本目的在于實現某一特定功能,對于終端用戶而言,其中所蘊含的技術是不必也無需知道的,因為只要其獲得目標代碼并在一定的環境下運行,計算機就可以自動識別并實現其所預期的技術功能,其所支付的購買成本即可以得到償付?？梢哉f,軟件銷售行業的商業運行對普通終端用戶而言,僅僅是一種技術功能實現成本的交易。由于本身缺乏相應的技術知識和背景,獲取源代碼并知悉其中的技術思想對普通的軟件消費者而言毫無意義,如欲規避該功能實現成本,只需要非法復制該軟件的目標代碼并在計算機上運行即可。因此,一般情況下,軟件開發完畢之后,最終用戶只能獲得目標代碼和用戶手冊,除非有特殊約定或公開許可,源代碼是作為軟件開發者的商業秘密,不予提供。然而,誠如上文所述,對于軟件開發行業來說,源代碼的地位卻是至關重要的,獲取了已有軟件的源代碼就可以輕易的獲知其中的技術思想和訣竅,并在此基礎上改進開發,或研究其漏洞,從而大大縮短原有的技術開發成本,研究出改進、替代產品,并從中獲取商業利潤。

二、軟件源代碼單一版權法保護的優勢和不足

目前,除少數技術比較發達的國家允許純軟件專利(P21-22)之外,各國對計算機軟件主要采用版權法保護模式。無可否認,版權保護能成為當今世界軟件立法的主流,必然有其內在優勢和可行性:首先,版權保護范圍廣泛。版權法對作品的創作水平要求較低,即所謂只須具有創造性火花(Creative Spark),而不必達到新穎的、完美的或巧妙的(Novel、Unique or Ingenious) (P24-25)。其次,版權自動保護原則,使源代碼從編碼完成即受保護,至多也只須進行注冊登記,手續簡便,成本低廉;最后,版權法保護范圍有限。只保護表達,不保護創作思想,其他開發者可借鑒已有軟件的技術思想進行創新和優化。

然而,源代碼的技術性特征使得其不可能與傳統版權法所有理念和內容完全吻合,國外有學者甚至認為:“包含計算機程序會導致著作權制度的歪曲 (P77-78)”。

1. 傳統版權法的立法目的與源代碼功能技術性特征不符。

正如通產省1983年《程序法建議》所述,“版權法的宗旨是促進文化發展,而軟件保護則主要在于促進工業或其他產業的發展 (P100)”。日本1970年《著作權法》、韓國1987年《著作權法》及我國臺灣地區《著作權法》均在第一條開宗明義地規定,本法的目的是為促進國家文化向上發展 (P1-2)。事實上,版權的產生和發展,源于人類對自身精神領域的關注,是對人類傳播思想、文化、藝術,從閱讀、欣賞、評價中得到思想升華和精神愉悅的肯定。而源代碼則與此完全不同,其開發、編寫、內容、表達都具有鮮明的實用目的和功能性用途,

2. 傳統版權法以文化作品為標準的概念和規則在源代碼領域不適用。

按照上述立法目的,傳統理論將版權保護的作品界定為“對文藝、學術、美術以及音樂范圍內的思想及感情的創造性的表達” (P447)。而源代碼從產生時起,就是一種實用技術工具。雖然表達具有文字屬性,但僅用于轉換為機讀的指令序列,即由機器識別、執行,這與傳統作品的作用大不相同。因此,有學者認為,“程序本身幾乎沒有或根本沒有任何實際意義,其意義只有在計算機運行的過程中才能顯示出來。因此,它作為作品的法律地位在某種程度上是無效的 (P204)”。

3. 傳統版權法思想――表達二分法的基本原則與源代碼的“雙重屬性”的沖突。

版權法僅保護富有創意的表達,并不延及創意本身和技術功能,這已成為國際版權保護的共識。只要是非抄襲的獨立創作且表達方式有異,即使與已有作品思想雷同,亦符合版權原創性要求。然而,源代碼兼具表達與技術雙重屬性,其根本價值在于作者的技術構思和功能性步驟設計。同時,其表達的多樣性受到諸多限制。這就可能產生十分不合理的結果:一方面,某些基礎功能的最優編碼方式可能僅有一種,保護此表達,實際上就間接壟斷了該技術思想。另一方面,只要了解軟件源代碼的技術思想,再以不同的表達方式重新編寫,就能輕易規避版權保護。這一弊端,是軟件版權保護最易受攻擊的弱點。

另外,文學作品的版權保護期限較長,一般為作者終身加死后50年。而大多數軟件壽命較短,只有幾年使用時間。因此,50年的保護期對軟件而言意義不大。

三、軟件源代碼單一商業秘密法法保護的優勢和不足

從一定意義上講,軟件的商業秘密保護是一種“收底”的保護方式,由于其具有很強的靈活性和主動性,在保護軟件源代碼領域具有明顯優勢。

1. 它滿足了權利人壟斷性權利與技術不公開的雙重要求,在避免專利理念沖突的同時,保護了源代碼中的技術思想。

源代碼是軟件開發的技術核心,是開發人員最重要的智慧財富。對此,專利法無法逾越其公開要求,而版權法則對保護思想無能為力。商業秘密保護則正好彌補了二者的缺陷,它保護技術思想和功能,同時并不要求公開,甚至還特別要求權利人必須采取保密措施。這就滿足了權利人壟斷并不愿意公開技術的雙重要求。當然,不公開技術也就相應的無法享受專利法的絕對壟斷,商業秘密法保護的力度和效力較之專利法而言明顯較弱,然而事實上,這種相對弱勢的保護方式對于軟件業的技術革新而言是不無裨益的。

2. 其保護門檻低,保護力度和期限靈活,權利人有充分的自主性,非常適合軟件行業周期短,革新快,競爭激烈的行業特征。

3. 對開發者未來潛在利益的保護:首先,可以有效防止他人在其軟件基礎上進行后續開發。其次,可以低成本壟斷技術及其更新,維護軟件產品的后續利益。如后期技術服務、漏洞補正、界面和擴展性的完善等,微軟公司在操作系統 Windows3.1的基礎上不斷推出Windows95、98、Professional及至Windows XP,就是最好例證。最后,可以維護軟件安全性,防止因源代碼泄露而被他人利用產品安全漏洞攻擊計算機網絡。

然而,單一商業秘密保護也存在弊端:首先,商業秘密法的保護力度有限,往往只能通過軟件銷售協議或雇用合同中的保密條款主張相關違約或侵權責任,或者依靠開發者自身的保密措施,難以達到令人滿意的效果。其次,商業秘密法無法禁止合法獲取秘密信息后完全復制和使用。商業秘密法只禁止對源代碼的非法獲取,不禁止“通過公平和誠實的方法”獲取,按照TRIPS規定,主要指“公平誠實的反向工程和獨立開發”。因此,若第三人破譯了權利人的技術保護,用反向工程獲取源代碼,就有權對其進行任何形式的使用,包括在新軟件中完全照搬,形成內容和功能都完全相同的軟件。當然,在現實生活中,這種原封不動的照搬并無意義,因為盜版目標代碼即可達到同樣效果。事實是第三人往往以反向工程復制部分源代碼用于自己的軟件,產生功能有所差異的新軟件。對此,商業秘密法無能為力。

四、軟件源代碼版權與商業秘密保護的良性互補

在軟件保護領域,版權法與商業秘密法可否并存?對此,美國第二巡回上訴法院在“阿爾泰”一案中確認了二者的并存及各自適用的范圍 (P18)?！笔聦嵣?“版權與商業秘密在軟件保護中建立了一種精妙的良性互動關系,他們彼此間的支持與配合,既可以克服單一版權保護的‘先天不足’,又可以避免軟件專利保護的不當。二者的結合,在不沖擊現有知識產權體系和符合社會公共政策目標的同時,為軟件業,特別是軟件源代碼,提供了有效、正當的保護(P50)”。

1. 商業秘密法保護側重于保護對象的內容,兼顧了軟件源代碼的技術思想和文字表達,實現了對源代碼雙重屬性的“雙重保護”,彌補了版權法的保護漏洞。

源代碼兼具表達的文字性和功能的技術性,其技術思想和結構是開發人員最重要的智慧財富。但版權法受其立法目的所限,嚴格依照“思想―表達兩分法”界定保護范圍。商業秘密法則恰好兼顧了這種雙重要求:從立法目的上看,商業秘密保護關注的不在于表達本身,而在于表達信息的內容;從保護對象上看,其既保護“表達”,也保護“思想”,任何采取不正當手段或違約獲取和使用“信息”的行為都在禁止之列。這就滿足了權利人對軟件源代碼技術思想的關注,有效彌補了版權法保護的缺漏。同時,商業秘密法保護期限、力度的靈活性也彌補了版權法保護期限和范圍僵化的不足。

2. 版權法則有效克服了商業秘密法保護的不足。商業秘密法無法解決的保護力度有限,無法防止合法取得而引發的復制和后續使用的問題完全可以用版權法來補充:一旦源代碼取得著作權,就意味著即使合法獲得,對其進行任何形式的復制和直接使用,甚至是非常類似的表達都將構成侵權。

總之,在版權法和商業秘密法的結合保護體系下,版權自動產生,不以權利人公開為條件,同時,版權法并不禁止將同一作品的一種表現形式(源代碼)予以保密,而同時公開該作品的另一種形式(目標代碼)。因此,權利人完全可以發行目標代碼滿足普通用戶的使用,而將源代碼作為商業秘密嚴加保護。版權法和商業秘密法分別保護源代碼的“表達”和“思想”,各司其職,相互協調。

此時,對源代碼的獲取和使用就存在以下四種情況:(1)若他人非法獲悉源代碼并進行復制,則構成對版權和商業秘密的雙重侵犯;(2)若其非法獲取源代碼,但僅閱讀并理解其中的結構思想,未復制其表達(如,為發現漏洞編寫病毒程序),則只構成對商業秘密的侵犯;(3)若其采用反向工程等合法手段突破權利人的保密措施獲取源代碼,并將其用于新軟件的編碼過程,則只構成版權侵權;(4)若其合法獲取源代碼后僅抽取其中的思想重新編碼,且不構成與權利人源代碼的實質相似,則不構成侵權。

當然,軟件源代碼的這種雙重保護體系,還需對版權法和商業秘密法本身進行必要的修改和協調,如擴展版權法立法宗旨和對象,修改以傳統文化作品為標準的各項概念和規則以及滌清二者各自的適用范圍和具體內容等。

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篇4

摘要：目的 研究烏飯樹樹葉及其提取物對視網膜免受光損傷的保護功能。方法 將20只新西蘭白兔分成4組：正常對照組和模型對照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。正常對照組動物自由攝取飼料，自由飲水；模型對照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組動物除自由攝取飼料，自由飲水外，每天分別喂烏飯樹新鮮樹葉[50g/(kg?d)]、烏飯樹陳舊樹葉[50g/(kg?d)] 和烏飯樹樹葉提取物[50mg/(kg.d)]，連續4周。并且進行強光刺激，同時利用視網膜電圖(ERG)進行視網膜分析，最后處死白兔測定視網膜中丙二醛(MDA) 的含量和總超氧化物岐化酶(TSOD)的活力。結果 ERG測定結果發現，對照組B波的潛伏期時間延長而振幅降低，模型組白兔ERG的變化趨勢正好相反。同時模型組視網膜中的MDA含量要低于對照組(P

關鍵詞：烏飯樹；提取物；視網膜；光損傷

The protective effect of Vaccinium Bracteatum Thunb leaves　and the extract against light injury of retina

Wang Li， Zhang Xuetong， Yao Huiyuan

(School of Food Science and Technology， Southern Yangtze University， Wuxi 214036;Department of Ophthalmology of the Wuxi No.4 Peoples Hospital， Wuxi 214036， China)

ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of the extract of Vaccinium Bracteatum Thunb (VBT) leaves against light injury of retina. Methods 20 Newzealand rabbits were pided into 4 groups: the normal control group， modelⅠgroup， modelⅡ group， and model Ⅲ group. The normal control group ate and drank freely. modelⅠgroup ate and drank freely but took in 50g/(kg?d) fresh VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅱgroup ate and drank freely， but took in 50g/(kg?d) old VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅲ group ate freely， but took in 50mg/(kg?d) extract of VBT leaves(resolved in water) daily for 4 weeks. All rabbits were exposed to strong light， meanwhile， the retinas were analyzed by electroretinogram (ERG) every week. Finally， all the rabbits were killed and the content of MDA and SOD in the retina were detected. Results In the control group， the latency time of the B wave increased and the amplitude of the B wave shortened， while in the model Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ groups， the changes of B wave just opposite. The content of MDA in the model Ⅰ，Ⅱ， and Ⅲ groups was lower than that in the control group(P

KEY WORDS: Vaccinium Bracteatum Thunb(VBT); extract; retina; light injury

烏飯樹是杜鵑花科的一種植物，我國南北各地均產，很多中藥類書籍中都記載其對人體具有保健作用[12]。國外對烏飯樹同種屬植物的果實進行研究發現，其對多種眼科疾病均有很好的治療效果，目前很多國家都已經把烏飯樹紫黑漿果中提取出的色素類物質用于眼科醫療領域。意大利、法國、西班牙、韓國、美國以及新西蘭等國家已經將其應用于夜盲癥、毛細管脆弱、腦血管障礙、胃潰瘍的治療[34]。本研究采用強光刺激損傷白兔視網膜，同時喂食烏飯樹樹葉或其提取物，利用視網膜電圖技術(electroretinogram， ERG)對白兔視網膜進行研究，然后對視網膜進行丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)含量分析，最后對其保護機理進行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭大白兔20只，購自江南實驗動物場，體重(2.5±0.5)kg。

1.1.2 藥品與試劑 烏飯樹樹葉，購自于江蘇溧陽；烏飯樹樹葉提取物，實驗室自制；美多麗眼液，參天制藥株氏會社(日)；倍諾喜眼液，參天制藥株氏會社(日)；總蛋白含量測試盒，購自于南京建成生物研究所； MDA含量測定試劑盒，購自于南京建成生物研究所； SOD活力測定試劑盒，購自于南京建成生物研究所；PBS(磷酸鹽緩沖液)：800mL蒸餾水中溶解8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀，用鹽酸調節pH至7.4，加水定容至1L，在1.034×105Pa高壓下殺菌20min，保存于室溫。

1.1.3 主要儀器 全視野閃光刺激器，重慶醫用電子儀器廠；視覺電生理檢查與診斷系統VETSⅢB，重慶醫用電子儀器廠。

1.2 方法 20只新西蘭大白兔適應性喂養1周，自由攝取飼料，自由飲水。然后用1000W強光照射，刺激眼睛視網膜產生光損傷，同時按照不同的組別進行喂養食物，每周進行ERG的測量。具體分組如下：正常對照組：自由攝取飼料，自由飲水。模型對照Ⅰ組：自由攝取飼料，自由飲水，另外每天喂烏飯樹新鮮樹葉，按照50g/(kg?d)劑量喂養，連續4周。模型對照Ⅱ組：自由攝取資料，自由飲水，另外每天喂烏飯樹陳樹葉，按照50g/(kg?d)劑量喂養，連續4周。模型對照Ⅲ組：自由攝取飼料，另外每天喂烏飯樹樹葉提取物(溶解于飲水中)，按照50mg/(kg?d)劑量喂養，連續4周。

1.2.1 ERG的測量 記錄電極為角膜式接觸電極，參考電極和接地電極為普通電極。預先用剪刀剪去白兔額部毛，再用剃須刀刮干凈。進行ERG測量操作前先用美多麗眼液對白兔進行擴瞳，暗適應30min，眼角膜用倍諾喜進行麻醉。分別利用藍光、白光和紅光對白兔視網膜進行刺激(在白光刺激后明適應30min再進行紅光刺激測定)。記錄電極置于兔子眼角膜表面，參考電極置于靠近兔子額部，用膠布固定，接地電極置于兔子耳朵上，用膠布固定。測量時，兔子頭部置于刺激球中央，對單只眼睛視網膜進行刺激。刺激條件：高頻85Hz，低頻0.1Hz，刺激光亮度1.5Log，單次刺激。記錄儀進行同步記錄，經過儀器分析得到B波的延滯時間(以ms為單位)和振幅(以μV為單位)，進行分析。

1.2.2 視網膜勻漿的制備 于實驗30d后將白兔處死，摘除眼球，仔細去除眼內容物，剝離視網膜，置于冰冷的玻璃勻漿器中，冰浴下碾磨5min，制成勻漿，10000r/min高速離心15min，取上清液待用。

1.2.3 總蛋白含量的測定 蛋白質上的氨基(-NH3+)與考馬斯亮蘭染料上的陰離子結合，能夠使溶液從棕紅色變為藍色，通過測定吸光度值可以計算出其中的蛋白質含量。取組織勻漿50μL，按照試劑盒配制試劑，并且進行測量。

1.2.4 MDA的測定 過氧化脂質的分解產物-MDA與硫代巴比妥酸作用后形成紅色物質，利用分光光度計測定吸光度，可以計算出其中的丙二醛含量。按照試劑盒配制試劑，并且進行測量。

1.2.5 總超氧化物岐化酶(TSOD)活力的測定 通過黃嘌呤以及黃嘌呤氧化酶反應體系產生超氧陰離子自由基[O-2?]，氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，當樣品體系中含有SOD時，則對[O-2?]有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值要低于對照管的吸光度，通過計算可以得出視網膜中SOD的活力。按照試劑盒配制試劑并且測量。

2 結果

2.1 ERG測定結果 ERG分別由PⅠ、PⅡ和PⅢ三個導程構成，B波是ERG中屬于其中的PⅡ導程部分，緊隨A波后的一個正相波。它起源于光感受器與神經節細胞之間的神經通路中的一種光興奮活動，可能來自雙極細胞或Müller細胞。它反映視網膜內核層區域細胞的電活動，并且反應非常迅速，受外界因素的影響較為明顯，如缺氧、溫度變化以及不同的光刺激等，因此B波作為評價視網膜功能可靠而靈敏的客觀指標之一，近年來越來越受到重視。在本研究中測定白兔在受強光刺激后暗視ERG、暗反應最大波和明視ERG中B波的變化。在實驗中采用三種光(藍光、白光、紅光)對白兔視網膜進行刺激，其中藍光測定值代表的是暗視ERG，白光測定值代表的是暗反應最大波，而紅光測定值代表的是明視ERG。具體結果見表1-3。

2.2 白兔眼睛視網膜抗氧化指標的檢測結果 實驗30d后，將白兔的視網膜取出，進行適當的處理，測定其中的MDA和TSOD含量，前者可以反映視網膜脂質過氧化的程度，而后者則反映其中抗氧化酶體系活力的變化。具體結果見表4。

表1 白兔暗適應ERG――B波的潛伏期及振幅的變化（略）

Table 1 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the dark adaptation ERG of the rabbits

Model Ⅰ：fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves

*P

表2 白兔暗反應最大波――B波的潛伏期及振幅的變化（略）

Table 2 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the scotopic threshold response of the rabbits

Model Ⅰ：fed with fresh leaves ; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ:fed with the extracts from leaves

*P

表3 白兔明視ERG――B波的潛伏期及振幅的變化（略）

Table 3 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the photopic ERG of the rabbits

Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves

*P

表4 不同實驗組別白兔眼睛視網膜抗氧化酶體系的檢測結果（略）

Table 4 The contents of the MDA and SOD in the retina of different groups

Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves

*P

3 討論

從表1-3中可以看出，隨著實驗時間的延長，對照組B波的潛伏期逐漸延長，而模型組(Ⅰ-Ⅲ)則都在一定程度上有所降低，而B波振幅的變化趨勢正好相反。

由于視桿細胞對藍光敏感，因此暗視藍光ERG主要反映的是眼睛視網膜中視桿細胞的變化。從表1中的變化趨勢可以看出，烏飯樹樹葉和其提取物對視桿細胞具有明顯的改善作用。

視錐細胞對紅光敏感，所以明視ERG主要反映的是眼睛視網膜中視錐細胞的變化。從表2中的變化趨勢可以看出，烏飯樹樹葉和其提取物對視錐細胞同樣具有明顯的改善作用。

暗反應最大波是視網膜明視系統和暗視系統的混合反映，其中的B波是視桿細胞興奮后產生的電位變化，可能起源于Müller細胞或雙極細胞。其反映視網膜內核層區域細胞的電活動，取決于視網膜內信號傳遞過程的完整性[5]。從表3可以看出，烏飯樹樹葉和其提取物對于視網膜的視覺系統有很強的維護作用。

從表1-3還可以看出新鮮樹葉和陳樹葉對于視網膜的保護作用基本一致，說明在新鮮樹葉儲藏期間沒有功能性物質的損失，或者是損失很少，這樣也就可以為原料的儲藏提供了一些依據。

MDA是脂質過氧化的產物，通常被用來衡量脂質過氧化的程度。視網膜的視細胞外節主要是盤膜結構，內含豐富的長鏈多不飽和脂肪酸，在受到光的作用后，易從位于兩個雙鍵之間的亞甲基上脫去氫原子，形成質子自由基，然后發生雙鍵和未配對電子位置的轉移，形成較穩定的共軛雙鍵，再與氧反應，形成質子自由基和質子過氧化物。這些自由基再攻擊其他不飽和脂肪酸，引起連鎖反應，從而使盤膜以及線粒體膜和內質網膜的脂類受到損害。

環境光的損傷被認為是一種光化學損傷。感光器外段富含長鏈不飽和脂肪酸，內段富含線粒體，對氧的需求大，當光子被視紫紅質吸收后可產生一系列的自由基，它們與感光器和視網膜色素上皮(RPE)中的不飽和脂肪酸發生反應，發生脂質過氧化反應，引起眼睛組織破壞。從表4中可以看出，對照組的白兔眼睛視網膜中MDA的量大大超過正常白兔眼睛視網膜中的量[6]，說明實驗中的強光刺激對白兔眼睛有了很嚴重的損傷；而模型組Ⅰ-Ⅲ的白兔視網膜中的MDA含量接近于正常白兔眼睛視網膜中的量，說明白兔食用烏飯樹樹葉或樹葉提取物后，視網膜內部的脂質過氧化得到了有效的抑制。其主要原因應該是由于烏飯樹樹葉含有豐富的黃酮類物質[4]，黃酮類物質具有很強的清除自由基能力，而視網膜光化學損傷的主要發病機制是脂質體過氧化[7]，所以在實驗中服用烏飯樹樹葉或其提取物的白兔視網膜受到很好的保護。

視細胞中含有大量的線粒體，其中的呼吸鏈在進行電子傳遞時可產生自由基，如輔酶Q是醌類化合物，通過氧化還原可生成半醌自由基。視細胞中的視黃醛或視黃醇受可見光照時也可產生自由基。許多研究表明，視網膜的光損傷是光照激發產生自由基，引起組織發生過氧化的結果。在正常情況下，機體內自由基的產生與清除過程處于動態平衡，在遭受各種外界因素的影響時，平衡被破壞，機體受損。視網膜本身具有一定的抗氧化能力，在一定程度上可以預防光化學損傷。它各層均存在清除自由基的天然保護系統，包括抗過氧化物酶和自然抗氧化劑[8]，它們可以通過各種化學反應而終止自由基鏈反應，達到清除有害自由基，防止組織破壞的目的。從表4可以看出，對照組白兔眼睛視網膜中SOD要遠低于其他3個模型組，說明烏飯樹樹葉以及其提取物能夠有效地保護視網膜中的SOD，使其能夠保持活性。視網膜抗氧化能力下降時，容易受到光的損傷，反之在受到光的刺激損傷后，視網膜中的抗氧化酶體系必定發生變化。從表4可以看出，對照組的白兔眼睛視網膜中SOD的量大大低于正常白兔眼睛視網膜中的量[6]。有實驗表明，光照可以使細胞內SOD水平下降[9]，而SOD是生物體內自由基清除劑之一，可以促進超氧化物陰離子自由基的岐化反應。在本研究中可能的機理是烏飯樹樹葉及其提取物能夠將超氧陰離子自由基[O-2?]轉變為O2和H2O，清除其毒性作用，減輕和防止過氧化，從而達到保護視網膜的作用。同時，從表4可以得出結論，新鮮樹葉和陳樹葉可以達到基本一致的效果。

綜上所述，烏飯樹是一種很豐富的天然資源，其功能在很多中藥典籍中都有記載，但是目前的應用不是很廣泛，原因是人們對它的功能和具體的作用機理不了解。本研究發現烏飯樹樹葉或其提取物能夠有效地預防保護視網膜免受光損傷，服用50g/(kg?d)的烏飯樹樹葉或者50mg/(kg?d)的提取物，可以起到明顯的效果。

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篇5

【摘要】 目的: 探討腹腔注射銀杏葉提取物（Ginkgo biboba extract，EGb 761）對豚鼠視神經橫斷傷后視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell， RGC）形態及功能的保護作用。方法: 75只白化豚鼠隨機等分為正常對照組、假手術組、模型組、生理鹽水組和EGb 761組。分離暴露豚鼠的右眼視神經并于球后1.0 mm處進行橫斷造模，正常對照組不作任何處理，假手術組僅分離暴露視神經。生理鹽水組和EGb 761組分別于實驗開始前1周每日腹腔注射1次相應體積生理鹽水和EGb 761（100 mg/kg），術后繼續給藥4周。術后第4天，各組隨機處死3只豚鼠，采用脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling， TUNEL)法檢測RGC凋亡；分別于術后第14和28天進行圖形視網膜電圖（pattern electoretinogram， PERG）檢查；摘取眼球作組織病理學檢查并計數視網膜垂直經線RGC數目。結果: 術后第4天，正常對照組、假手術組和EGb 761組均未見TUNEL陽性RGC，模型組和生理鹽水組均見有TUNEL陽性RGC。術后第14和28天，模型組和生理鹽水組RGC數目均少于正常對照組和假手術組（P

【關鍵詞】 銀杏葉提取物; 視神經損傷; 視網膜神經節細胞; 圖形視網膜電圖; 神經保護; 豚鼠

Objective: To investigate the effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) on the morphology and function of retinal ganglion cells (RGC) in guinea pigs with optic nerve transection.

Methods: Seventyfive albino guinea pigs were randomly pided into five groups: normal control group， shamoperated group， untreated group， normal saline group and EGb 761 group. No operation was performed in the normal control group. Optic nerve was merely exposed in the shamoperated group， but transected at 1.0 mm from posterior pole of the eye ball in the untreated， normal saline and EGb 761 groups. Guinea pigs in the EGb 761 group or the normal saline group received daily intraperitoneal injection of EGb 761 (100 mg/kg) or corresponding volume of normal saline from 7 days before experiment to 28 days after experiment. Three guinea pigs in each group were sacrificed for apoptosis assay (TUNEL method) of RGC. Pattern electoretinograms (PERGs) were recorded 14 and 28 days after transection， respectively. At the end of the examination， six guinea pigs were killed for histological examination and RGC count.

Results: No TUNELpositive cells were observed in the normal control， shamoperated and EGb 761 groups， but there were TUNELpositive cells in the untreated group and the normal saline group. The numbers of RGCs in the untreated and normal saline groups were less than those in the normal control and shamoperated groups at 14 days or 28 days (P

Conclusion: EGb 761 can inhibit the apoptosis of RGCs in guinea pigs after optic nerve transection， thus protect the morphology and function of RGCs.

Keywords: Ginkgo biloba extract; optic nerve lesion; retinal ganglion cell; pattern electroretinogram; neuroprotective effect; guinea pigs

青光眼是一種威脅視神經視覺功能，主要與眼壓升高有關的眼病，也是目前我國第二大致盲眼病。雖然青光眼的具體發病機制尚不清楚，但目前一致認為視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell， RGC）凋亡為青光眼神經損害的中心環節。研究證明銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract，EGb 761）具有抗氧化［1］、抗缺血［2］、保護線粒體［3］和抑制一氧化氮合酶活性［4］等廣泛的生物學效應。因此，我們采用橫斷豚鼠球后視神經的方法建立RGC損傷模型觀察EGb 761對RGC結構的保護作用，并采用圖形視網膜電圖（pattern electroretinogram， PERG）評價EGb 761對RGC功能的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 75只雌性白化豚鼠，體質量190～210 g，購于中國科學院上海實驗動物中心，許可證號為SCXK（滬）2007005。

1.1.2 實驗藥物及試劑 EGb 761，17.5 mg/支（5 mL），批號為9941209C，德國威瑪舒培博士大藥廠產品；速眠新Ⅱ注射液，又名846合劑，1 mg/mL，軍事醫學科學院軍事獸醫研究所產品，批號為(2004)005013；陸醒寧注射液，1 mg/mL，軍事醫學科學院軍事獸醫研究所產品，批號為(2006)006011；甲基纖維素，上海建華精細生物制品有限公司產品；脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling， TUNEL）檢測試劑盒，美國Promega公司產品；碘化丙啶（propidium iodide，PI），美國Sigma公司產品。

1.1.3 實驗設備 手術顯微鏡（SM2000J，上海軼德醫療設備有限公司）；PERG檢查儀(EP1000，日本Tomey公司)；熒光顯微鏡（Axioplan 2，德國Zeiss公司）；光學顯微鏡（Olympus BX50，日本Olympus公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 豚鼠使用嚴格遵循視覺與眼科研究協會（Association for Research in Vision and Ophthalmology， ARVO）有關視覺和眼科研究動物使用條款。所有豚鼠均在12 h明/12 h暗，溫度為22～25 ℃，濕度為55%～60%的環境中飼養。采用計算機隨機數字法將75只豚鼠分為5組：正常對照組、假手術組、模型組、模型+生理鹽水組（生理鹽水組）、模型+EGb 761組（EGb 761組），每組15只。每只鼠的右眼為實驗眼，左眼為用于計算RGC存活指數的對照眼。

1.2.2 視神經橫斷方法 按照Nakazawa等［5］報道的方法進行視神經橫斷，建立豚鼠視神經橫斷模型。臀部注射速眠新Ⅱ注射液0.6 mL/kg麻醉后，在手術顯微鏡下剪開外眥角；自12∶00處沿角膜緣逆時針呈180°打開球結膜并向后鈍性分離暴露視神經，鈍性分離視神經鞘表面的血管后于球后1.0 mm處橫斷球后視神經。分別縫合球結膜和外眥角，涂金霉素眼膏。手術結束后立即在臀部注射陸醒寧（1.2 mL/kg）催醒。術中盡可能鈍性分離血管以不影響眼球的血液供應，同時盡可能減少對視神經的牽拉。

1.2.3 各組處理方法 正常對照組：不給任何處理；假手術組：按造模方法暴露視神經，但不橫斷；模型組：按上述視神經橫斷方法橫斷視神經；生理鹽水組：于實驗前7 d腹腔注射生理鹽水，每日1次，體積參照EGb 761的劑量，視神經橫斷后繼續注射28 d；EGb 761組：于實驗前7 d腹腔注射EGb 761，劑量為100 mg/kg［6］，每日1次，持續至視神經橫斷后繼續注射28 d。視神經橫斷后第4天，各組隨機處死3只豚鼠，摘取眼球作石蠟切片，進行RGC凋亡的TUNEL標記檢測。分別于視神經橫斷后14 d和28 d進行PERG檢查，檢查后每組處死6只豚鼠作視網膜組織病理學檢查，并作RGC計數。

1.2.4 TUNEL檢測RGC凋亡 按TUNEL檢測試劑盒說明書提供的方法進行石蠟切片和常規脫蠟。用蛋白酶K孵育后滴加TUNEL反應混合液，最后用PI襯染細胞核。經上述處理后，在熒光顯微鏡下進行觀察并采用AxioVision軟件進行同步圖像采集，視網膜組織中凋亡的RGC細胞核呈黃色熒光著色。

1.2.5 組織學檢查及RGC存活指數計算 分別于造模后第14和28天采用速眠新Ⅱ注射液(0.6 mL/kg)腹腔注射麻醉后，按我們以往的方法［7］，在角膜緣12∶00位縫線作標記并摘取眼球固定于10%甲醛液中，眼球摘除后再注射過量麻藥處死。眼球固定24 h后沿12∶00至6∶00經線并沿視神經中央對剖開眼球，棄去晶狀體和玻璃體，保留眼球壁。常規脫水、包埋、連續切片（3張）、蘇木素伊紅染色、封片。在光學顯微鏡下，從12∶00至6∶00鋸齒緣（經視盤中央），計數整個經線上RGC核的數目，以其左眼作對照計算RGC的存活指數［8］，每眼計數3張，取其平均值。計算公式：存活指數=（右眼垂直經線RGC數目/左眼垂直經線RGC數目）×100%。

1.2.6 PERG記錄方法 按BenShlomo等［9］報道的方法記錄PERG。采用日本Tomey系統，軟件為EP1000 Vision 1.2.3，刺激方式為棋盤格，刷新頻率為65 Hz，通頻帶設為5～100 Hz，平均疊加次數30～60次，取樣頻率為2 000 Hz，刺激間隔時間為338 ms。豚鼠在自然光適應狀態下，用速眠新Ⅱ注射液麻醉后固定于一個可以三維移動的動物實驗臺上（自制）。記錄電極為環形氯化銀電極，滴加14 mg/mL甲基纖維素后固定于右眼角膜緣處，不銹鋼針制作的參考電極和地極，分別置于被檢眼同側顳側皮下和背部。豚鼠的角膜緣與熒光屏平行，角膜頂點與刺激野中心距離為20 cm，然后于明適應狀態下記錄。每眼記錄3次以上，取其平均值。按照國際臨床視覺電生理學會（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision， ISCEV）推薦的方法從P50的波峰至N95的波谷測量N95振幅［10］。

1.3 統計學方法 所有數據采用x±s表示。采用SAS 6.12統計軟件包進行單因素方差分析，如差異有統計學意義，則進行各組均數間兩兩比較（StudentNewmanKeuls test， SNK）；RGC數目和P50波振幅相關性檢測采用直線相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 EGb 761對RGC凋亡的影響 凋亡細胞的細胞核在3通道激發光下呈綠色熒光著染，所有細胞核在5通道激發光下呈紅色熒光著染，在8通道激發光下凋亡細胞的細胞核呈黃綠色或黃色熒光著染。正常對照組和假手術組視網膜神經節細胞層均未見黃色熒光著染的RGC。模型組和生理鹽水組均見有較多強熒光著染的RGC。EGb 761組未見熒光著染的RGC。見圖1。

2.2 光學顯微鏡觀察 豚鼠視網膜可見清晰的10層組織學結構，但全層無血管樣結構。正常對照組神經纖維層較厚，RGC呈立方形，排列緊密，胞漿豐富，核飽滿，染色較均勻，而膠質細胞胞體較小，核深染。假手術組除RGC略為稀疏外，與正常對照組無明顯差異。視神經橫斷后28 d，模型組和生理鹽水組RGC的數目明顯減少，神經纖維層明顯變薄且RGC稀少，胞體變小。EGb 761組RGC胞體與正常大小無明顯區別，但數目略少。見圖2。

2.3 EGb 761對RGC存活指數的影響 正常豚鼠視網膜垂直經線上RGC的數目為（318±13）個。視神經橫斷后14 d時，模型組與生理鹽水組RGC存活指數顯著低于正常對照組和假手術組（P

圖1 TUNEL檢測EGb 761對RGC凋亡的影響（熒光顯微鏡，×400）（略）

Figure 1 Effects of EGb 761 on RGC apoptosis checked by TUNEL (Fluorescein microscopy， ×400)

GCL: Ganglion cell layer; INL: Inner nuclear layer; ONL: Outer nuclear layer; TUNEL: DeadEnd fluorometric terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling; PI: Propidium iodide. A: Normal control group， no TUNEL positive RGCs; B: Shamoperated group， no TUNELpositive RGCs in retina; C: Untreated group， a few TUNEL positive RGCs (white arrows) presented in retina; D: Normal saline group， a few TUNELpositive RGCs (white arrows) presented in retina; E: EGb 761 group， no TUNELpositive RGCs presented in retina.

圖2 HE染色觀察EGb 761對視網膜組織結構的影響 (光學顯微鏡，×400)（略）

Figure 2 Effects of EGb 761 on retinal structure observed by HE staining (Light microscopy， ×400)

GCL: Ganglion cell layer; INL: Inner nuclear layer; ONL: Outer nuclear layer. A: Normal control group. There was no vascular structure in retina， and cubic RGCs arrayed regularly and the nerve fibers layer (NFL) of retina was thick. B: Shamoperated group. The number of RGCs was close to that in normal control group. C: Untreated group. The number of RGCs and the thickness of NFL were obviously less than those in normal control group. D: Normal saline group. RGCs were rare and NFL was very thin. E: EGb 761 group. The number of RGCs and the NFL were slightly less than those in normal control group. All cells white arrows pointed at were RGCs.

圖3 視神經橫斷后14和28 d各組RGC存活指數（略）

Figure 3 Survival index of RGC in each group 14 and 28 days after optic nerve transection

A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group. Data were represented as x±s， n=6. *P

2.4 EGb 761對PERG N95振幅的影響 視神經橫斷14 d時模型組和生理鹽水組N95振幅下降，顯著低于正常對照組、假手術組和EGb 761組（P0.05）。視神經橫斷28 d時模型組和生理鹽水組N95振幅進一步下降，顯著低于正常對照組、假手術組和EGb 761組（P0.05）。見圖4和圖5。

2.5 N95振幅與RGC存活指數的相關性 對N95振幅和RGC的存活指數進行相關分析，結果為N95振幅與RGC的存活指數呈正相關關系，相關系數r為0.858 68（P=0.001 5）。見圖6。

圖4 視神經橫斷后14和28 d各組N95 振幅的變化（略）

Figure 4 Changes of N95 amplitude in each group 14 and 28 days after optic nerve transection

A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group. Data were represented as x±s， n=6. *P

圖5 視神經橫斷后28 d各組PERG波形（略）

Figure 5 PERG wave form in each group 28 days after optic nerve transection

N35: Negative wave 35; P50: Positive wave 50; N95: Negative wave 95. A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group.

圖6 N95振幅與RGC存活指數的相關關系（略）

Figure 6 Correlation of N95 amplitude with survival index of RGC

3 討論

EGb 761主要含有黃酮苷（24%）和萜類內酯（6%）兩種成分。黃酮類化合物主要有槲皮素、山奈黃素、異鼠李素。萜類內酯除銀杏內酯外還有銀杏苦內酯A、B、C和J。該制劑可抗脂質過氧化，對缺血和（或）缺氧損傷、機械損傷的神經元具有保護作用。它能減輕谷氨酸毒性，抑制血小板凝集，對抗凋亡，還能使眼動脈血流量增加。本研究結果證明EGb 761能抑制視神經橫斷后RGC凋亡，對RGC有保護作用，該結果與Hirooka等［11］的研究結果一致。

PERG是客觀評價RGC功能的方法之一，其波形主要特征為一個正向的P50波和一個向下的N95波。根據各種疾病PERG的不同表現，Holder［12］認為兩個波的起源不同。藥理學分析也證明，N95波可被河豚毒素完全阻斷，N95波依賴于RGC產生的動作電位。盡管P50波的確切起源還不清楚，并不能被河豚毒素阻斷，但在青光眼患者和猴青光眼模型中P50波振幅均有所下降，因此推測它可能起源于RGC的胞體和（或）RGC的遠端［13］。以往評價慢性高眼壓引起的RGC數目減少常常采用閃光ERG［14］，然而閃光ERG只代表視網膜外層電反應，PERG才真正代表視網膜內層電反應［15， 16］。迄今，盡管對PERG的確切起源尚未完全清楚，但起源于視網膜內層是一致公認的，主要是RGC［17］。Berardi等［18］證實橫斷大鼠視神經后可引起RGC逆行性變性，導致PERG反應消失，而閃光ERG不受影響。目前PERG已被應用于臨床評價高眼壓癥和青光眼患者的視功能，并認為青光眼對PERG的N95的影響比P50大［19， 20］。BenShlomo等［9］首次應用PERG評價大鼠高眼壓后RGC功能，并研究N95振幅和RGC數目的相關性，結果發現兩者呈正相關關系。我們的研究也證明豚鼠視神經橫斷后，隨著RGC數目的減少N95振幅逐漸降低，且兩者呈正相關關系（r=0.858 68，P=0.001 5），表明PERG的N95振幅可評價RGC數目喪失的程度。

總之，腹腔注射EGb 761可抑制視神經橫斷后RGC凋亡，從而保護RGC的結構和功能。PERG是評價視神經橫斷后RGC喪失程度的有效指標之一。

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