基因組學研究精選(五篇)

序言：作為思想的載體和知識的探索者，寫作是一種獨特的藝術，我們為您準備了不同風格的5篇基因組學研究，期待它們能激發您的靈感。

篇1

藥物基因組學是伴隨人類基因組學研究的迅猛發展而開辟的藥物遺傳學研究的新領域，主要闡明藥物代謝、藥物轉運和藥物靶分子的基因多態性及藥物作用包括療效和毒副作用之間關系的學科。

基因多態性是藥物基因組學的研究基礎。藥物效應基因所編碼的酶、受體、離子通道作為藥物作用的靶，是藥物基因組學研究的關鍵所在。基因多態性可通過藥物代謝動力學和藥物效應動力學改變來影響物的作用。

基因多態性對藥代動力學的影響主要是通過相應編碼的藥物代謝酶及藥物轉運蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉運、代謝和生物轉化等方面。與物代謝有關的酶有很多，其中對細胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多。基因多態性對藥效動力學的影響主要是受體蛋白編碼基因的多態性使個體對藥物敏感性發生差異。

苯二氮卓類藥與基因多態性：咪唑安定由CYP3A代謝，不同個體對咪唑安定的清除率可有五倍的差異。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代謝，基因的差異在臨床上可表現為用藥后鎮靜時間的延長。

吸入與基因多態性：RYR1基因變異與MH密切相關，現在已知至少有23種不同的RYR1基因多態性與MH有關。氟烷性肝炎可能源于機體對在CYP2E1作用下產生的氟烷代謝產物的一種免疫反應。

神經肌肉阻滯藥與基因多態性：丁酰膽堿酯酶是水解琥珀酰膽堿和美維庫銨的酶，已發現該酶超過40種的基因多態性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，與用藥后長時間窒息有關。

鎮痛藥物與基因多態性：μ-阿片受體是阿片類藥的主要作用部位，常見的基因多態性是A118G和G2172T。可待因和曲馬多通過CYP2D6代謝。此外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。兒茶酚O-甲基轉移酶(COMT)基因與痛覺的產生有關。

局部與基因多態性：羅哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代謝。CYP1A2的基因多態性主要是C734T和G2964A，可能影響藥物代謝速度。

一直以來麻醉科醫生較其它專業的醫療人員更能意識到不同個體對藥物的反應存在差異。的藥物基因組學研究將不僅更加合理的解釋藥效與不良反應的個體差異，更重要的是在用藥前就可以根據病人的遺傳特征選擇最有效而副作用最小的藥物種類和劑型，達到真正的個體化用藥。

能夠準確預測病人對麻醉及鎮痛藥物的反應，一直是廣大麻醉科醫生追求的目標之一。若能了解藥物基因組學的基本原理，掌握用藥的個體化原則，就有可能根據病人的不同基因組學特性合理用藥，達到提高藥效，降低毒性，防止不良反應的目的。本文對藥物基因組學的基本概念和常用的藥物基因組學研究進展進行綜述。

一、概述

二十世紀60年代對臨床麻醉過程中應用琥珀酰膽堿后長時間窒息、硫噴妥鈉誘發卟啉癥及惡性高熱等的研究促進了藥物遺傳學（Pharmacogenetics）的形成和發展,可以說這門學科最早的研究就是從麻醉學開始的。

藥物基因組學(Phamacogenomics)是伴隨人類基因組學研究的迅猛發展而開辟的藥物遺傳學研究的新領域，主要闡明藥物代謝、藥物轉運和藥物靶分子的基因多態性及藥物作用包括療效和毒副作用之間的關系。它是以提高藥物的療效及安全性為目標，研究影響藥物吸收、轉運、代謝、消除等個體差異的基因特性，以及基因變異所致的不同病人對藥物的不同反應，并由此開發新的藥物和用藥方法的科學。

1959年Vogel提出了“藥物遺傳學”,1997年Marshall提出“藥物基因組學”。藥物基因組學是藥物遺傳學的延伸和發展，兩者的研究方法和范疇有頗多相似之處，都是研究基因的遺傳變異與藥物反應關系的學科。但藥物遺傳學主要集中于研究單基因變異，特別是藥物代謝酶基因變異對藥物作用的影響；而藥物基因組學除覆蓋藥物遺傳學研究范疇外，還包括與藥物反應有關的所有遺傳學標志，藥物代謝靶受體或疾病發生鏈上諸多環節，所以研究領域更為廣泛[1,2,3]。

二、基本概念

1．分子生物學基本概念

基因是一個遺傳密碼單位，由位于一條染色體(即一條長DNA分子和與其相關的蛋白)上特定位置的一段DNA序列組成。等位基因是位于染色體單一基因座位上的、兩種或兩種以上不同形式基因中的一種。人類基因或等位基因變異最常見的類型是單核苷酸多態性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)。目前為止，已經鑒定出13000000多種SNPs。突變和多態性常可互換使用，但一般來說，突變是指低于1%的群體發生的變異，而多態性是高于1%的群體發生的變異。

2．基因多態性的命名法：

(1)數字前面的字母代表該基因座上最常見的核苷酸(即野生型)，而數字后的字母則代表突變的核苷酸。例如：μ阿片受體基因A118G指的是在118堿基對上的腺嘌呤核苷酸(A)被鳥嘌呤核苷酸(G)取代，也可寫成118A/G或118A>G。

(2)對于單個基因密碼子導致氨基酸轉換的多態性編碼也可以用相互轉換的氨基酸的來標記。例如：丁酰膽堿酯酶基因多態性Asp70Gly是指此蛋白質中第70個氨基酸－甘氨酸被天冬氨酸取代。

三、藥物基因組學的研究內容

基因多態性是藥物基因組學的研究基礎。藥物效應基因所編碼的酶、受體、離子通道及基因本身作為藥物作用的靶，是藥物基因組學研究的關鍵所在。這些基因編碼蛋白大致可分為三大類:藥物代謝酶、藥物作用靶點、藥物轉運蛋白等。其中研究最為深入的是物與藥物代謝酶CYP45O酶系基因多態性的相關性[1,2,3]。

基因多態性可通過藥物代謝動力學和藥物效應動力學改變來影響藥物作用，對于臨床較常用的、治療劑量范圍較窄的、替代藥物較少的物尤其需引起臨床重視。

（一）基因多態性對藥物代謝動力學的影響

基因多態性對藥物代謝動力學

的影響主要是通過相應編碼的藥物代謝酶及藥物轉運蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉運、代謝和生物轉化等方面[3,4,5,6]。

1、藥物代謝酶

與物代謝有關的酶有很多，其中對細胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多。

（1）細胞色素P-450（CYP45O）

物絕大部分在肝臟進行生物轉化，參與反應的主要酶類是由一個龐大基因家族編碼控制的細胞色素P450的氧化酶系統，其主要成分是細胞色素P-450（CYP45O）。CYP45O組成復雜，受基因多態性影響，稱為CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反應CYP45O基因超家族內的進化關系的統一命名法：凡CYP45O基因表達的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的視為同一家族（Family），以CYP后標阿拉伯數字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%為同一亞族（Subfamily），在家族表達后面加一大寫字母，如CYP2D；每一亞族中的單個變化則在表達式后加上一個阿拉伯數字，如CYP2D6。

（2）丁酰膽堿酯酶

麻醉過程中常用短效肌松劑美維庫銨和琥珀酰膽堿，其作用時限依賴于水解速度。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是水解這兩種藥物的酶，它的基因變異會使肌肉麻痹持續時間在個體間出現顯著差異。

2、藥物轉運蛋白的多態性

轉運蛋白控制藥物的攝取、分布和排除。P-糖蛋白參與很多藥物的能量依賴性跨膜轉運，包括一些止吐藥、鎮痛藥和抗心律失常藥等。P-糖蛋白由多藥耐藥基因（MDR1）編碼。不同個體間P-糖蛋白的表達差別明顯，MDR1基因的數種SNPs已經被證實，但其對臨床麻醉的意義還不清楚。

（二）基因多態性對藥物效應動力學的影響

物的受體（藥物靶點）蛋白編碼基因的多態性有可能引起個體對許多藥物敏感性的差異，產生不同的藥物效應和毒性反應[7,8]。

1、藍尼定受體-1（Ryanodinereceptor-1，RYR1）

藍尼定受體-1是一種骨骼肌的鈣離子通道蛋白，參與骨骼肌的收縮過程。惡性高熱（malignanthyperthermia,MH）是一種具有家族遺傳性的、由于RYR1基因異常而導致RYR1存在缺陷的亞臨床肌肉病，在揮發性吸入和琥珀酰膽堿的觸發下可以出現骨骼肌異常高代謝狀態，以至導致患者死亡。

2、阿片受體

μ-阿片受體由OPRM1基因編碼，是臨床使用的大部分阿片類藥物的主要作用位點。OPRM1基因的多態性在啟動子、內含子和編碼區均有發生，可引起受體蛋白的改變。嗎啡和其它阿片類藥物與μ-受體結合而產生鎮痛、鎮靜及呼吸抑制。不同個體之間μ-阿片受體基因的表達水平有差異，對疼痛刺激的反應也有差異，對阿片藥物的反應也不同。

3、GABAA和NMDA受體

γ-氨基丁酸A型（GABAA）受體是遞質門控離子通道，能夠調節多種物的效應。GABAA受體的亞單位（α、β、γ、δ、ε和θ）的編碼基因存在多態性（尤其α和β），可能與孤獨癥、酒精依賴、癲癇及精神分裂癥有關，但尚未見與物敏感性有關的報道。N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體的多態性也有報道，但尚未發現與之相關的疾病。

（三）基因多態性對其它調節因子的影響

有些蛋白既不是藥物作用的直接靶點，也不影響藥代和藥效動力學，但其編碼基因的多態性在某些特定情況下會改變個體對藥物的反應。例如，載脂蛋白E基因的遺傳多態性可以影響羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（他汀類藥物）的治療反應。鮮紅色頭發的出現幾乎都是黑皮質素-1受體（MC1R）基因突變的結果。MC1R基因敲除的老鼠對的需求量增加。先天紅發婦女對地氟醚的需要量增加，熱痛敏上升而局麻效力減弱。

四、苯二氮卓類藥與基因多態性

大多數苯二氮卓類藥經肝臟CYP45O代謝形成極性代謝物，由膽汁或尿液排出。常用的苯二氮卓類藥物咪唑安定就是由CYP3A代謝，其代謝產物主要是1-羥基咪唑安定，其次是4-羥基咪唑安定。在體實驗顯示不同個體咪唑安定的清除率可有五倍的差異。

地西泮是另一種常用的苯二氮卓類鎮靜藥，由CYP2C19和CYP2D6代謝。細胞色素CYP2C19的G681A多態性中A等位基因純合子個體與正常等位基因G純合子個體相比，地西泮的半衰期延長4倍，可能是CYP2C19的代謝活性明顯降低的原因。A等位基因雜合子個體對地西泮代謝的半衰期介于兩者之間。這些基因的差異在臨床上表現為地西泮用藥后鎮靜或意識消失的時間延長[9,10]。

五、吸入與基因多態性

到目前為止，吸入的藥物基因組學研究主要集中于尋找引起藥物副反應的遺傳方面的原因，其中研究最多的是MH。藥物基因組學研究發現RYR1基因變異與MH密切相關，現在已知至少有23種不同的RYR1基因多態性與MH有關。

與MH不同，氟烷性肝炎可能源于機體對在CYP2E1作用下產生的氟烷代謝產物的一種免疫反應，但其發生機制還不十分清楚[7,11]。

六、神經肌肉阻滯藥與基因多態性

神經肌肉阻滯藥如琥珀酰膽堿和美維庫銨的作用與遺傳因素密切相關。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是一種水解這兩種藥物的酶，已發現該酶超過40種的基因多態性，其中最常見的是被稱為非典型的（A）變異體，其第70位發生點突變而導致一個氨基酸的改變，與應用肌松劑后長時間窒息有關。如果丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態性雜合子(單個等位基因)表達，會導致膽堿酯酶活性降低，藥物作用時間通常會延長3～8倍；而丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態性的純合子(2個等位基因)表達則更加延長其恢復時間，比正常人增加60倍。法國的一項研究表明，應用多聚酶鏈反應（PCR）方法，16例發生過窒息延長的病人中13例被檢測為A變異體陽性。預先了解丁酰膽堿酯酶基因型的改變，避免這些藥物的應用可以縮短術后恢復時間和降低醫療費用[6,12]。

七、鎮痛藥物與基因多態性

μ-阿片受體是臨床應用的阿片類藥的主要作用部位。5%～10%的高加索人存在兩種常見μ-阿片受體基因變異，即A118G和G2172T。A118G變異型使阿片藥物的鎮痛效力減弱。另一種阿片相關效應—瞳孔縮小，在118G攜帶者明顯減弱。多態性還可影響阿片類藥物

的代謝。

阿片類藥物的重要的代謝酶是CYP2D6。可待因通過CYP2D6轉化為它的活性代謝產物－嗎啡，從而發揮鎮痛作用。對33名曾使用過曲馬多的死者進行尸檢發現，CYP2D6等位基因表達的數量與曲馬多和O－和N－去甲基曲馬多的血漿濃度比值密切相關，說明其代謝速度受CYP2D6多態性的影響。除CYP2D6外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。已證實CYP3A4在其它阿片類藥如芬太尼、阿芬太尼和蘇芬太尼的代謝方面也發揮重要作用。

有報道顯示兒茶酚O-甲基轉移酶(COMT)基因與痛覺的產生有關。COMT是兒茶酚胺代謝的重要介質，也是痛覺傳導通路上腎上腺素能和多巴胺能神經的調控因子。研究證實Val158MetCOMT基因多態性可以使該酶的活性下降3～4倍。Zubieta等報道，G1947A多態性個體對實驗性疼痛的耐受性較差，μ-阿片受體密度增加，內源性腦啡肽水平降低[13～16]。

八、局部與基因多態性

羅哌卡因是一種新型的酰胺類局麻藥，有特有的S-(-)-S對應體，主要經肝臟代謝消除。羅哌卡因代謝產物3-OH-羅哌卡因由CYP1A2代謝生成，而4-OH-羅哌卡因、2-OH-羅哌卡因和2-6-pipecoloxylidide(PPX)則主要由CYP3A4代謝生成。CYP1A2的基因多態性主要是C734T和G2964A。Mendoza等對159例墨西哥人的DNA進行檢測，發現CYP1A2基因的突變率為43%。Murayama等發現日本人中CYP1A2基因存在6種導致氨基酸替換的SNPs。這些發現可能對藥物代謝動力學的研究、個體化用藥具有重要意義[17,18,19]。

九、總結與展望

篇2

關鍵詞：藥物基因組學；中藥；基因組技術

中圖分類號：[R932] 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2013）44-0160-02

中藥是中華民族的瑰寶，隨著生物科技的發展，我們也越來越關注運用現代科學技術對中藥進行全面研究。基因組學是20世紀末發展起來的一門科學，隨著人類基因組計劃的完成及后基因組時代的到來，藥物基因組（Pharmacogenomics），即研究遺傳變異與藥物反應相互關系的一門學科，是以提高藥物的療效和安全為目標，已成為新的研究重點。藥物基因組學的發展為中藥現代化提供了良好契機。

一、基因組學概述

1.基因組學定義。基因組學（Genomics）是研究基因組的科學，它以分子生物學、電子計算機和信息網絡技術為研究手段，以生物體內全部基因為研究對象，在全基因組背景下和整體水平上探索生命活動內在規律及內在環境對機體影響機制的科學。它從全基因組的整體水平，而不是單個水平，來研究生命這一具有自組織和自裝配特性的復雜系統，認識生命活動的規律，從而將更加接近生命的本質和面貌。

2.基因組研究內容。基因組學作為一門新興學科，根據其研究對象，研究的重點及研究的目的不同，又分成多分支學科。根據研究的重點不同，基因組學可以分為結構基因組學和功能基因組學，結構基因組學以全基因組測序為目標，而功能基因組學以基因功能鑒定為目標。根據研究的對象不同還可將基因組學分為疾病基因組學、比較基因組學、藥物基因組學和環境基因組學等。基因組研究可以理解為：①基因表達概況研究，即比較不同組織和不同發育階段、正常狀態與疾病狀態，以及體外培養的細胞中基因表達模式的差異，技術包括傳統的RTPCR，RNase保護試驗，RNA印跡雜交等。②基因產物-蛋白質功能研究，包括單個基因的蛋白質體外表達方法，以及蛋白質組研究。③蛋白質與蛋白質相互作用的研究，利用酵母雙雜交系統，單雜交系統（one-hybrid system），三雜交系統（thrdee-hybrid system）以及反向雜交系統（reverse hybrid system）等。

二、中藥研究中常用的基因組技術

1.基因芯片技術。基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）、DNA微陣列，是基于核酸、探針互補雜交技術原理，將大量的寡核酸片段按預先設定的排列順序固化在載體表面如硅片或玻片上，并以此為探針，在一定的條件下與樣品中的待測的靶基因片段或DNA序列雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來實現對靶序列信息的快速檢測和分析。目前已成為基因表達分析的最常用工具。基因芯片技術具有高通量、并行、高內涵的特點，這就為探索中藥作用機理開辟了新領域。現代藥理學分子水平研究表明藥物作用都有其靶點，基因芯片可以確定靶組織的基因表達模式，從而將中藥作用的靶基因全部顯示出來。如陳明偉利用基因芯片技術檢測中藥單體人參皂苷20（R）Rg3對腫瘤血管生長調控因子（VEGF）蛋白表達的抑制作用。基因芯片技術還有助于確定中藥有效部位，通過基因芯片技術迅速篩選起作用的中藥有效成分。此外，基因芯片技術在中藥材鑒定，道地藥材篩選，中藥新藥研發等方面都有重要的應用。

2.DNA分子標記技術。①RAPD技術。RAPD即隨機擴增多態性DNA，在1990年由Welsh與Williams等人發展起來，是建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子技術。其以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態核苷酸序列（通常為10個堿基對）為引物，在熱穩定的DNA聚合酶作用下，進行PCR擴增。RAPD技術能快捷地辨別出不同遺傳物質之間最微小的DNA偏差，而且耗材較少，不必提前獲知其基因堿基順序，通過對遺傳資源的分析，從遺傳多樣性中得到詳盡的遺傳信息。現在，RAPD技術已成功鑒定細辛、蒲公英、龍膽草、人參及西洋參等藥材。②RELP技術。RELP技術即限制性長度多態性分析技術，就是將DN段用限制性內切酶消化后，進行限制性片段長度多態性分析。RELP技術可以確定基因種屬的特異性和藥材的鑒定。陳美蘭采用PCR-RFLP方法從分子水平鑒定人參中有效成分人參皂苷的含量，克服了因人參分布易受生長環境、儲存條件和加工等諸因素影響，采用傳統的形態學和組織學方法難以鑒別的缺點。

3.PCR技術。PCR技術即聚合酶鏈式反應技術，是體外擴增DNA序列的技術，廣泛應用于目的基因的制備等幾乎所有的分子生物學領域。DNA的保存需要嚴格的條件，在正常的中藥材加工和儲存過程中是很難做到的。王嚴明等通過PCR技術從保存了9年的藥材龜板中提取DNA，成功進行了DNA指紋鑒定。

4.DNA測序技術。DNA測序技術，即測定DNA序列的技術。在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。該技術包括單向測序（Single-Read Sequencing），雙向測序（Paied-End Sequencing）混合樣品測序（Indexed Sequencing）。DNA測序技術在中藥品質研究中有重要的應用，劉玉萍等采用PCR直接測序技術測定半夏及其偽品的18SrRNA基因核苷酸序列并作序列變異和選擇性內切酶譜（PCR-SR）分析，為半夏正品鑒別提供分子依據。此外，該技術還可以用于中藥的品質鑒定，仇萍等通過DNA指紋圖譜從分子水平對中藥材種質進行準確分析，從而為鑒定藥材的真偽優劣提供依據。

三、展望

基因組學研究已把揭示生命本質提高到了一個全新水平，同樣它在中藥各個領域的滲透也使中藥發展有了更廣闊的前景，將推動中藥在種材培育、藥材鑒定、機理闡述和新藥研發的進步，促進中藥走出中國，走向世界。

參考文獻：

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[7]王亞明，周亞光，吳平等.中藥龜板和鱉甲中DNA的提取和擴增[J].藥學學報，1996，31（6）：472-476.

篇3

關鍵詞： 功能基因組； 西瓜； 甜瓜； 黃瓜

功能基因組學（functional genomics），又被稱為后基因組學（post-genomics），它是利用結構基因組學提供的豐富信息和產物，借助高通量、大規模的試驗分析方法，在全基因組或系統水平上研究基因的功能，弄清生物體中各組分是如何工作并形成有功能的細胞、組織及整個生物體[1]。其目標是明確基因組中全部基因的功能， 揭示植物生長發育、環境應答互作的分子網絡， 從而全面闡釋植物的生物學基礎。目前，水稻、擬南芥等模式植物功能基因組學研究發展較快，近幾年隨著科技進步和資金投入的不斷增加，葫蘆科作物基因組研究也取得了一定的成果。西瓜基因組全長約425 Mb，甜瓜約450 Mb，黃瓜約376 Mb[2]， 基因組大小比較適合開展基因組測序和功能基因組研究。2007年由西班牙牽頭組織，美國、中國、法國、以色列、日本等國家的14個實驗室聯合啟動了國際葫蘆科基因組計劃（International Cucurbit Genomics Initiative，ICuGI），該計劃為瓜類蔬菜的基因組學研究奠定了良好的技術平臺。在此基礎上，2008年相繼啟動了葫蘆科三大作物西瓜、甜瓜、黃瓜的全基因組測序計劃[3]。隨著基因組測序工作的陸續完成，瓜類作物基因組研究逐步進入到功能基因組研究時代。本文綜述了近些年植物功能基因組學主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黃瓜上的應用概況。

1 高通量、大規模EST測序及功能解析

EST（Express Sequence Tag）是指通過對cDNA 文庫中隨機挑取的克隆進行大規模測序所獲得的cDNA 的5’或3’端序列，長度一般為150～500 bp。EST是基因編碼序列的一部分，通過與數據庫中已知功能的基因序列進行對比，從理論上可推測其基因功能。EST已發展成為新基因發現的有效途徑，也是植物功能基因組學研究的重要工具。隨著測序技術的不斷改良和測序成本的降低，高通量、大規模EST測序及功能解析開始廣泛應用。

西瓜EST研究方面，A. Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構建了西瓜果實發育不同時期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫，獲得了832條無冗余EST，序列比對分析表明有410個EST-unigenes與已知編碼蛋白的基因同源，按功能歸類分屬于初級代謝、氨基酸合成組裝、細胞膜運輸、細胞分裂、細胞壁代謝、細胞骨架和細胞形成、基因轉錄和表達、信號轉導、抗性防御和次級代謝。這些潛在的功能基因序列為日后開展西瓜果實發育和品質形成的遺傳與功能基因組研究奠定了基礎。呂桂云等[5]通過構建枯萎病菌誘導的西瓜根系組織SSH-cDNA文庫，對測序獲得的4 431條高質量EST序列進行聚類拼接，獲得1 756個非重復序列，基因功能分類表明抗病與防御相關基因約占36.3%，對獲得的西瓜與枯萎病非親和互作中部分特異性表達的基因進行了初步探討，發現可能參與西瓜與枯萎病菌非親和互作的轉錄因子、激酶和防衛基因及茉莉酸和木質素2個主要代謝途徑。Guo等[6]采用Roche/454新一代測序技術，從西瓜4個果實發育期（授粉后10、18、26、34 d）獲得了577 023個高質量EST，組裝成了75 068個unigenes，有54.9% 的unigenes與GeneBank中的已知基因同源，其中2/3來源于黃瓜。Gene Ontology （GO）注釋表明，有33 853個unigenes（45.1%）獲得至少1個GO術語，被注釋序列的基因功能分屬于分子功能（molecular function）類別、生物過程（biological process）類別和細胞組分（cellular component）類別，所占比例分別為38.6%、38.6%和36%，另外大約29%的unigenes同時具有以上3種功能分類。生物過程類別的基因主要參與細胞過程、代謝過程和生物合成過程，表明果肉組織在發育過程中發生了廣泛的代謝活動。數字基因表達譜分析及實時定量PCR驗證表明有3 023個基因在果實發育不同時期存在顯著的表達差異，表達量差異至少在2倍以上。研究發現細胞壁相關基因在未成熟白瓤果肉組織中高效表達，而類葫蘆卜素代謝基因（八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素-β環化酶）、蔗糖代謝基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果實發育不同時期差異表達明顯，作者對與果實品質相關的一些生化途徑如纖維素合成、木栓質合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等進行了進一步鑒定。

甜瓜大規模EST測序及功能解析方面，Nurit Katzir等[7]通過構建甜瓜EST數據庫，從4 800條序列中鑒定出與甜瓜果實香味代謝相關的3類基因家族，乙醇乙酰轉移酶、倍半萜合酶和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶，克隆得到候選基因的全長序列，研究了這些基因在不同甜瓜品種間的表達模式。Daniel Gonzalez-Ibeas等[8]通過對8個來源于甜瓜不同組織和生理狀態的cDNA文庫（包括授粉后15 d和46 d的2個果實的文庫）測序和序列拼接、組裝，獲得16 637個無冗余EST。通過與擬南芥基因組做生物信息學比對分析，發現眾多個與果實發育相關的基因，如ACC合成酶、ACC氧化酶、細胞壁代謝酶、類胡蘿卜素合成代謝酶、MADS-box 基因等。實時定量PCR表明在果實成熟期乙烯受體基因EIN4表達量翻倍，表明該基因與果實成熟期乙烯信號調控相關。MADS-box 基因SVP在果實成熟期表達量下降了4倍，番茄紅素ε環化酶基因（LUT2）和木葡聚糖內糖基轉移酶基因（TCH4）表達量也下降了4倍。2011年，Christian Clepet等[9]構建了4個不同類型甜瓜品種不同植物組織的11個全長cDNA文庫和4個標準化cDNA文庫，分別獲得71 577 條和22 179條EST，能夠組裝成24 444條unigenes，基因對比顯示有75%～85%的序列與雙子葉植物同源，70%與單子葉植物同源，有6 972個基因家族在雙子葉植物和單子葉植物間具有保守性。對數字基因表達譜研究，結果表明有175個基因為組織特異表達，這些基因為未來開展功能基因組研究提供了寶貴的資源。作者從這些序列中鑒定出了4 068個SSR和3 073個SNP，并對1 382個全長轉錄組進行了分析。為了解甜瓜對鹽脅迫的抗性反應機制，Shiwei Wei等[10]構建了耐鹽甜瓜品種根系組織的抑制消減雜交（SSH）cDNA文庫，測序獲得262條uni-ESTs，有161條序列與已知基因高度同源，128條與未知功能基因同源，有很多基因顯示與生物和非生物脅迫相關。研究表明，甜瓜耐鹽受眾多蛋白質調控，這些蛋白涉及細胞代謝、能量、轉錄、信號轉導、蛋白質命運以及細胞拯救和防御等生物過程，表明甜瓜作物耐鹽存在復雜的抗性反應機制。

在黃瓜上面，Dae-Jae Kim[11]構建了黃瓜子葉生長不同時期的cDNA文庫，篩選出大量與衰老相關的基因，利用半定量RT-PCR分析了365個克隆，發現有很多基因表達量提高，這些基因有些功能已知，有些功能未知。齊曉花等[12]采用SMART 技術構建了高抗白粉病的黃瓜品系JIN5-508 的葉片cDNA文庫，利用該文庫隨機挑選的8 352個克隆從5’端進行單向測序，共獲得8 035個有效的ESTs，序列的平均長度為838 bp。從文庫中篩選出了大量的低豐度表達基因，約占unigene總數的72.5%，1 991個unigenes 獲得分子功能注釋，其中與蛋白結合活性和催化活性相關的基因分別達到了41.34%和38.72%；在獲得功能注釋的unigene 中，有部分抗病抗逆相關基因高豐度表達，其中3個unigenes與擬南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8 和Mlo14 高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消減雜交技術（SSH）構建黃瓜胚胎發育早期和晚期差異表達cDNA文庫，經反向Northern blot雜交檢測，共得到97個陽性克隆。利用分子生物學軟件對測序后的序列進行質量檢測和聚類、拼接，共得到93個Uni-ESTs，其中包括86個singletons 和7個contigs。將上述EST序列在GenBank上進行BLAST比對，有83個EST片段找到了與之匹配的同源序列，有10 個EST片段未找到同源序列，推測可能是新基因。其中很多EST與擬南芥、水稻或玉米蛋白質數據庫中的熱激蛋白具有很高的同源性。將以上序列進行功能分類，發現在胚胎發育早期細胞防御和代謝過程占主要位置，而在胚胎發育晚期細胞防御和抗滲透脅迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黃瓜全雌系和雌雄同株系測序獲得353 941條EST，其中188 255條來源于全雌花，165 686條來源于雌雄花，結合5 600條GeneBank收錄的EST和mRNA序列，組裝成了81 401條unigenes。通過基因功能注釋和分析，預測了343個生化代謝途徑。對數字基因表達分析，表明大約200個基因在不同花性型存在差異表達，為研究植物花分化的分子機理提供了新的認識。潘宇等[15]構建了黃瓜授粉前后多個發育階段的幼果組織cDNA文庫，測序獲得116條EST，92.2% 的長度在400 bp以上，19% 為重疊序列。在GeneBank中進行BLAST分析后確認與已知功能基因相似的EST序列有71條，有相似序列而功能未知的基因和沒有相似序列的EST序列各占19.83% 和18.97%。

2 TILLING技術

TILLING（targeting induced local lesions in

genomes，定向誘導基因組局部突變技術），該技術借助高通量、標準化的檢測手段，快速有效地從經化學誘變劑（EMS）誘變過的突變群體中鑒定出點突變。與傳統的插入突變比，TILLING技術利用傳統的化學誘變獲得突變體，不需要耗時的轉基因和復雜的組織培養過程，具有高通量、低成本、高效率等諸多優勢。目前，TILLING作為一種全新的反向遺傳學研究方法已經用于多種植物。

TILLING技術在葫蘆科作物上的應用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakov Tadmor等[16]最先用EMS誘變構建了甜瓜品種Noy Yizreel的突變基因庫，共產生3 000個M2家系，發現了大量新的表型突變，大部分為隱性單基因控制。Fatima Dahmani-Mardas等[17]建立了甜瓜品種Char Mono （Cucumis melo L. subsp. melo var. cantalupensis）的TILLING技術平臺，CharMono系雌雄同株、呼吸躍變型，在M2現了大量子葉、莖蔓、花和果實發生的表型突變，利用與果實品質相關的11個基因篩選突變株系，發現大約每隔573 kb會發生一個突變，大部分都是G/C 突變成 A/T ，也有G/C 到 C/G，T/A到 A/T和C/G到A/T的變異，外顯子測序表明31.3%為基因沉默突變，65.1%為錯義，2.4%為轉錄終止，1.2%為拼接剪接突變，氨基環丙烷羧酸氧化酶基因CmACO1篩選到7個獨立的點突變，其中G194D果皮顏色變異明顯，果實延遲成熟黃化，而果形、可溶性固形物含量和果肉顏色仍然與野生型一樣。G194D自交純合株系也呈現出果實發育期延長、果肉變硬和果實延熟，并且在2個不同試驗地點表現一致，這些表型變異證明了G194D系CmACO1基因突變而來，該研究利用TILLING技術成功創造了甜瓜品質新資源，顯著提高了品種貨架期。Mireia González等[18]建立了甜瓜品種Piel de Sapo （Cucumis melo subsp. melo var. inodorus）的TILLING技術平臺，Piel de Sapo系雄全同株、非呼吸躍變型，EMS誘變得到2 368個M2家系，用病毒侵染抗性相關的2個基因Cm-eIF4E（核細胞翻譯起始因子）、eIF（iso）4E（核細胞翻譯起始因子異構體）、4個與果實成熟相關的基因ACO1、Cm-NOR、Cm-DET1、Cm-DHS（脫氧羧腐胺賴氨酸合酶）以及PDS（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發現有4個Cm-eIF4E等位基因突變，推測其中的2個改變了蛋白質功能，PDS有2個等位突變，發生在外顯子的突變改變了蛋白質功能，造成了苗期白化表型突變。4個與果實成熟相關的基因在群體中篩選突變，得到8個突變的家系。徐美紅等[19]用PCR產物直接測序和克隆測序2種方法用于檢測這8個突變家系的堿基變化。在直接測序中，4個突變家系的測序結果清晰，能夠確認堿基的變化；其他4個家系的結果不清晰，不能確認堿基的改變。在克隆測序中，8個家系的測序結果均清晰，能夠直接確定目的基因的點突變。在2種方法的比較中，克隆測序的準確率、效率明顯優于直接測序法。

黃瓜方面，以色列的R. Fraenkel等[20]通過EMS誘變獲得了大約1 000個M2家系，在苗期發現了諸如植株矮化、子葉自發病變、黃（花）葉、白化苗、葉片卷曲、窄型黑色子葉等諸多表型突變，利用PDS-3（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發現了4個突變家系，測序表明堿基突變均發生于基因內含子區域，因此并未造成相應的黃化表型突變。該套突變體庫為黃瓜反向遺傳學及基因功能研究奠定了很好的基礎。

西瓜作物TILLING技術的應用尚未見正式報道，美國農業部蔬菜研究實驗室的科學家目前正在從事相關的工作，預計將很快取得進展。

3 DNA芯片

DNA芯片是利用已知基因組序列，或來自未知序列的 cDNA 克隆制備模板 cDNA，通過人工或特定的儀器將大量模板 cDNA 按設計好的順序定量地固定在載體上制備成高密度的微陣列。將標記好的樣品 cDNA 片段（來自不同細胞、組織或整個器官）與模板上的cDNA 進行分子雜交。根據不同材料間基因差異表達的信息，推論某個基因的功能或鑒定和分離目的基因。DNA 芯片還廣泛應用于基因表達譜、突變基因篩選和轉基因鑒別等方面。

在西瓜上，Levi 等[4]通過與葉片cDNA消減雜交構建了西瓜果實發育不同時期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫。為進一步探究這些EST-unigenes在果實發育不同時期的轉錄表達差異，W. Patrick Wechter等[21]利用微列陣（microarray）技術對這些EST進行了差異表達分析，發現與葉片相比，有335個ESTs的表達存在明顯的差異，表達量差異至少在2倍以上。其中有211個與已知功能基因同源，96個為未知基因。這些基因參與了維管系統、類胡蘿卜素合成、轉錄調控、病原和逆境脅迫響應以及乙烯合成等，實時定量PCR也驗證了這些功能基因的差異表達。

在甜瓜上，張紅等[22]利用國內首個甜瓜cDNA 芯片Melon cDNA array ver1.0檢測了新疆厚皮甜瓜（Cucumis melo var. ameri）果實基因表達以及經60Co射線輻射誘變后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病變異株成熟果實基因的表達。結果顯示，該芯片平均能夠檢測新疆厚皮甜瓜基因2 008個，檢測出的基因占該芯片基因探針總數的65.4%。發現酸味抗病變異株上調表達的基因有251個，占檢出基因總數的12.5%，下調表達的基因224個，占檢出基因總數的11.16%。RT-PCR重復試驗表明用Melon cDNA array ver 1.0檢測新疆厚皮甜瓜成熟果實基因表達水平是可行的。Daniel Gonzalez-Ibeas等[23]利用抗西瓜花葉病毒甜瓜材料TGR-1551，感病材料Tendral，用DNA 芯片檢測了17 443個unigenes的表達，發現接種感染后TGR-1551比對照發生了顯著的轉錄差異，與空白對照相比，Tendral有 3 291個unigenes 差異表達，TGR-1551有2 488個unigenes 差異表達，共有677個unigene unigenes受到抑制表達。說明TGR-1551發生了廣泛、深刻的轉錄差異。

在黃瓜上，毛偉華等[24]通過GenBank搜索已的生物代謝途徑中的關鍵酶基因序列， 設計特異性引物， 采用RT-PCR法擴增這些酶的相應基因片段，在完成432個基因片段的克隆分離、測序和生物信息學分析工作的基礎上研制出國內首張黃瓜cDNA 芯片。該芯片含有9個質控cDN段和423個cDNA探針， 涉及光反應、卡爾文循環、碳水化合物代謝、水-水循環、信號傳導、激素代謝、光呼吸、防御、蛋白與氨基酸代謝等多個代謝途徑。利用該芯片對黃瓜缺鎂脅迫下基因表達譜進行了初步研究， 發現在缺鎂脅迫下差異表達的22個基因， 其中10個基因的表達受缺鎂處理抑制， 12個基因的表達受缺鎂處理誘導。該芯片的研制為進一步研究黃瓜功能基因的高通量時空變化提供了有效的技術支撐。為驗證該套cDNA芯片雜交結果的可靠性，毛偉華等[25]研究了黃瓜在CMV 侵染脅迫下的基因表達譜變化，并對其中5個具有代表性的基因通過實時熒光定量PCR（QRT—PCR）進行檢測，共獲得67個差異表達顯著的基因，其中42個基因下調表達，25個基因上調表達。這些差異表達的基因涉及了許多重要代謝途徑，許多與光合作用、氮同化相關的基因受到明顯的抑制，而一些防御相關基因和信號傳導相關基因則誘導表達。同時，也發現了一些與CMV 脅迫相關的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究發現，CMV 脅迫引發了黃瓜代謝發生一系列復雜的適應性變化，PR1-1a 等基因可能在黃瓜防御CMV侵染過程發揮著重要作用。

4 RNAi技術

RNAi（RNA interference）是一種雙鏈RNA （double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平關閉相應序列基因的表達或使其沉默的過程，也就是序列特異性的轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）。RNAi技術具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，根據表型變異可推測該基因的功能，RNAi已發展成為功能基因組學研究中基因功能鑒定的一種強有力的工具。

2012年，ANA M.等[26]利用RNAi技術沉默甜瓜 Cm-eIF4E（核細胞翻譯起始因子）基因，通過對轉基因T2代接種8種甜瓜易侵染的病毒，發現轉基因植株對黃瓜葉脈黃化病毒（CVYV）、甜瓜壞死斑病毒（MNSV）、摩洛哥西瓜花葉病毒（MWMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）產生抗性，表明Cm-eIF4E的存在造成甜瓜對這4種病毒的易感染性。Cm-eIF4E基因對于甜瓜作物廣譜高抗等位基因的發現，將是一個有效的選擇途徑。程鴻等[27]通過RT-PCR 方法從甜瓜中克隆得到白粉病感病相關基因CmMLO2 的cDNA 序列，RT-PCR 結果表明，CmMLO2 主要在甜瓜葉片中表達，具有組織特異性。在受到白粉病菌脅迫時CmMLO2表達顯著上調，表明CmMLO2 很有可能與白粉病發病有關。構建RNAi表達載體，利用葉盤轉化法轉化甜瓜，獲得了PCR 陽性植株，對白粉病接種鑒定結果表明，轉化植株對白粉病具有抗性，證明通過ihpRNAi敲除CmMLO2，可以獲得對白粉病具有抗性的甜瓜材料。

5 T-DNA插入突變

T-DNA（transferred DNA）是根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）內 Ti 質粒（tumor-inducing plasmid）上的一段 DNA， 它能侵染并穩定地整合到植物基因組中。由于插入的 T-DNA 序列已知， 插入到植物基因組中的T-DNA 類似于給基因貼了一個序列標簽。通過分離T-DNA 標簽位點的側翼水稻基因組序列， 可以快捷地找到含有標簽的基因， 經過插入標簽基因與突變體表型的共分離檢測， 從而獲得基因的生物學功能。任海英等[28]采用農桿菌侵染子葉外植體的方法產生T-DNA 插入的甜瓜突變體，篩選到一個蔓枯病抗性明顯增強的突變體，命名為edr2，該突變體是T-DNA 單拷貝插入甜瓜染色體引起的，edr2 的蔓枯病抗性和標記基因卡那霉素抗性基因共分離。蔓枯病菌在突變體甜瓜edr2上的侵染過程與在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌發率降低、芽管的伸長和菌絲的生長較遲緩。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突變體發生細胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的細胞發生程序性死亡。本研究為選育抗蔓枯病的甜瓜品種提供了新的思路，為挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。

6 展 望

西瓜[29]、甜瓜[30]、黃瓜 [31]全基因組測序已完成并對外公布，測序獲得的大量生物信息為開展功能基因組學研究奠定了基礎，也標志著瓜類作物基因組研究逐步進入到功能基因組研究時代。可以預測，未來將會有更多不同類型的cDNA文庫，包括全長cDNA文庫被構建，更多的EST序列將被釋放，從而為基因芯片的開發提供更多的源序列。另外，TILLING 、T-DNA突變體庫的構建工作也將陸續啟動或完成，更多的功能基因將被鑒定和分離。功能基因組研究的深入有望鑒定和分離出控制重要農藝性狀的全部基因， 揭示基因的時空表達模式，弄清在性狀形成中基因與基因的互作，并在此基礎上形成對基因調控網絡的認識。屆時人們就能夠從基因結構和基因表達調控兩個方面對基因進行修飾，在作物育種實踐中實現分子設計育種，從而培育出抗逆性強、品質優良、有益人體健康的西瓜、甜瓜、黃瓜品種，滿足人們不斷增長的消費需求。

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篇4

1 rnai及rnai文庫

rnai是近年來的重大發現，是動物和植物界普遍存在的一種防御反應。rnai被細胞內出現的雙鏈rna(dsrna)所激活，可以高度特異地抑 制同源基因的表達。根據目前的研究，rnai的可能機制如下：長片段dsrna在細胞內被ⅲ型rna酶dicer切成長度大約為19～23 nt的小片段干擾 rna(small interfering rna，sirna)，由sirna參與構成復合物risc(rna-induced silence complex)。 sirna通過與同源mrna的特異配對，引 導risc特異地降解同源mrna，導致基因表達的抑制。因此小片段的sirna也可以誘導高效的基因沉默。

在線蟲，注射或喂食dsrna能引起特異基因在動物各器官的沉默，而且該抑制作用可以持續到第一代的子代動物。但是在哺乳動物細胞 ，通過長片段dsrna直接轉染會引起細胞的毒性反應，基因沉默效果差。近年來，陸續有用體外合成的 sirna，或用質粒、病毒等載體在細胞內 表達 sirna達到在細胞和小鼠抑制特定基因表達的報道。

rnai文庫(rnai library)是人工構建的能通過誘導rnai抑制眾多不同基因表達的混合文庫，可以用于建立功能缺陷(loss offunction) 的生物或細胞庫，進行表型的篩選。該技術在線蟲的應用最為成功。在線蟲等模式生物的研究中，應用rnai文庫建立隨機基因抑制的線蟲，再 進行表型的篩選，已在其胚胎發育等領域取得了重要的發現。該文庫用含方向相對的兩個t7啟動子的載體，可從一個隨機克隆的cdna模板分別 轉錄出長片段的正義和反義rna，形成dsrna，在體內被dicer切割成小片段的sirna，特異地抑制靶基因的表達。由于細胞外dsrna不能在哺乳動 物細胞有效地誘導rnai，另外，長鏈dsrna(>30nt)可導致哺乳動物細胞的毒性反應，出現非特異的細胞生長停滯和凋亡，上述轉錄長片段dsrna 建立rnai文庫的方法不能應用于哺乳動物及其細胞。

線蟲等模式生物與人的差距較大，從模式生物獲得的研究結果雖然有比較重要的意義，但不能取代在人和其他高等動物的直接研究。因 此建立可以用于人的細胞以及其他哺乳動物細胞的rnai文庫有非常重要的意義。rnai文庫將為研究基因功能、發現新的藥物靶基因、發現疾病 相關基因、探索腫瘤治療新途徑等提供重要的方法。到目前為止，已經報道的在哺乳動物細胞建立rnai文庫的方案有兩類。我們將對這兩類建 庫方案及其在功能基因組學研究中的應用作一介紹。

2 哺乳動物細胞已知基因rnai文庫

哺乳動物細胞已知基因rnai文庫構建的方法如下：首先選定靶基因，根據靶基因的dna序列和sirna設計原則，合成sirna，或合成寡核 苷酸序列并克隆到表達載體，或用pcr的方法擴增為sirna表達盒。眾多針對不同基因的sirna或 sirna表達載體或表達盒即構成有限的rnai文庫 。應用該文庫轉染哺乳動物細胞可以特異地抑制不同基因的表達，通過表型的篩選來發現功能基因，如信號轉導通路新分子的篩選、與腫瘤細 胞存活或轉移相關基因的篩選等。

aza-blanc等應用dharmacon公司生產的針對510個基因(包括了大多數激酶基因)的sirna文庫，通過轉染hela細胞篩選了對trail誘導細 胞凋亡有調控作用的基因。trail是tnf家族的一員，具有抗腫瘤的功能。實驗證明，trail蛋白能同dr4和dr5受體結合，誘導多種腫瘤細胞的凋 亡，而對正常細胞沒有影響。aza-blanc等的篩選既發現了一些能增強trail誘導細胞凋亡的基因，也發現了一些具有抑制作用的基因。這些基因包括以前已知對trail功能有調控作用的基因如 gsk30α和srp72，也包括一些未知的調控 基因如 dobi、mirsa等，對了解trail的作用機制和抗腫瘤藥物的開發有重要的意義。

berns等構建了針對7914個基因的人rnai文庫。他們應用了shrna(short hairpin rna)反轉錄病毒載體，每一個基因構建了3個不同的 shrna載體，共有23742個不同的載體。用該 rnai文庫進行基因功能的篩選，發現了1個已知、5個未知的在p53依賴的增殖阻滯中起調控作用的 基因。進一步的研究證明，抑制這些基因的表達導致細胞對p53和p19arf依賴的增殖阻滯以及對 dna破壞誘導的g1細胞周期阻滯均 不敏感。 paddison等應用shrna病毒載體，構建了針對9610個人基因和5563個小鼠基因的shrna表達文庫。在26s蛋白酶系統的功能基因篩選中 ，證實該rnai文庫的實用性和可靠性。

zheng等構建了一個雙啟動子載體pdual。該載體包含兩個方向相對的聚合酶ⅲ啟動子，分別為小鼠的u6啟動子和人的h1啟動子，中間插 入能轉錄sirna的dna序列(圖1)。該載體的優點是，正義和反義rna從同一dna序列轉錄，減少了合成dna序列的長度，降低了費用和工作量。他 們巧妙地設計了能用pcr擴增的含雙啟動子的 sirna表達盒，并證實可以在哺乳動物細胞有效地抑制基因的表達。應用這一技術，他們構建了針 對8000個基因的sirna表達盒，在大規模的功能基因篩選中發現了一些已知和未知的在nf-kb信號轉導通路中起重要作用的基因。

silva等將sirna和sirna表達載體與轉染試劑混合后以微陣列的形式點在細胞培養板上，可以轉染在板上生長并與之接觸的活細胞。該 技術為應用rnai文庫進行細胞的基因功能篩選提供了一個簡單有效的方法。

上述研究均證明了有限的已知基因rnai文庫在哺乳動物細胞基因功能研究中的可行性，為哺乳動物及其細胞大規模功能基因組學的研究 提供了一個重要的技術。

已知基因rnai文庫存在以下缺陷：a．不是隨機rnai文庫，必須知道靶基因的序列，細胞基因的覆蓋面窄；b．針對每一個基因必須合成 2條以上寡核苷酸，才能確保從中選出干擾效果較好的；c．需要合成眾多的不同sirna，或構建眾多的不同載體；d．所需費用高，篩選的工作 量巨大。 

3 晡乳動物細胞隨機rnai文庫 

隨機rnai文庫(random rnai library)是人工構建的可能針對任何基因的rnai文庫。目前已報道的方法有兩種，一是通過化學合成隨機 dna序列的方法，二是通過cdna酶切并克隆到載體的方法。隨機rnai文庫不需要知道靶基因的序列，因此理論上講可以構成抑制任何基因表達的 干擾文庫，克服已知基因rnai文庫細胞基因覆蓋面窄的缺陷。該文庫同常用的基因表達文庫一樣，為不同 sirna載體的混合物，因此易于保存 ，顯著地減少了篩選的工作量。 

化學合成隨機dna序列構成隨機rnai文庫的方法是應用以下原理。在化學合成寡核苷酸時，如果堿基選為n，則dna合成儀在合成dna片段 時將隨機選擇a、t、g、c中的任何一種。19～21 nt的寡核苷酸如果部分或全部選為n時，則形成了眾多不同隨機序列寡核苷酸的混合物。在進 行互補鏈合成并克隆到雙啟動子rnai載體(見圖1的載體)后，就形成了隨機rnai文庫。 

限制性內切酶mme i的特點是在dna識別序列(tccgac)下游20～21 bp處切開dna片段。 luo等巧妙地應用mme i的獨特特性，設計了將長 cdna片段酶切為20～2l nt小dna片段，克隆于sirna表達載體構成隨機rnai文庫的方案，稱為speed。首先將隨機cdna片段與含mme i酶切位點發 夾結構的dna接頭(linker)連接，再用 mme i消化，獲得20～21 bp與接頭連接的cdna小片段。將形成的雙鏈dna打開成單鏈，合成互補鏈，形成 方向相對的兩個小片段cdna的拷貝，中間為不配對的形成發夾結構的dna序列。再克隆到反轉錄病毒載體中，構成隨機rnai文庫。利用小鼠胚胎 cdna文庫，他們建立了含3×106克隆、可以抑制眾多不同基因的隨機rnai文庫，證明該方法的可行性。 

shirane等應用同luo等基本相同的思路獨立地設計了構建隨機rnai文庫的方法，稱為 epril。應用鼠源fl5.12細胞的cdna文庫，他們建 立了隨機rnai文庫。對240個不同克隆的隨機測序發現，215個克隆含有正確的能表達sirna的 dna片段。blast分析顯示，165個克隆的插入片段 與己知基因或est的順序相吻合，絕大多數分屬不同的基因。這一結果說明，epril可以用于復雜基因的隨機rnai文庫的構建。 

篇5

【關鍵詞】宏基因組學；微生物群落；遺傳物質；口腔

【中圖分類號】Q781

【文獻標志碼】A

宏基因組學認為，生命研究的對象應是生物環境中全部微小生物的基因組，即特定環境下所有生物遺傳物質的總和。它包含了可培養的和不可培養的微生物的基因總和，微生物主要包括環境樣品中的細菌和真菌；因此，宏基因組學就是一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系以及與環境之間的關系等為研究目的的新的微生物群落研究方法，也稱為微生物環境基因組學、元基因組學或生態基因組學。

利用宏基因組學技術研究口腔微生物，無需單一分離培養某一種類的微生物，即可直接在基因水平上研究口腔微生物，包括可培養和不可培養微生物。宏基因組學應用于口腔微生物的研究，主要包括兩個方面：一方面進行微生物生態學研究，從整體微生物群落水平來研究口腔微生物，揭示口腔微生物群落多樣性及其變化；另一方面是進行口腔微生物及其基因的研究，從中篩選到新的功能基因及其產物。通過這兩方面的研究，較全面地了解口腔微生物的群落結構和功能基因組，為深入探索口腔微生物的代謝活動，最大限度地發掘口腔微生物資源提供可能。

1　宏基因組學的研究方法

宏基因組學是從特定環境中直接分離所有微生物的DNA，選擇合適的載體用于克隆DN段，將DN段克隆到宿主細胞中進行表達，根據某些生物活或基因序列篩選有價值的克隆并進行其功能分析。

1.1宏基因組文庫的構建

1.1.1環境微生物DNA的提取　環境樣品DNA的提取是基因組文庫構建中最重要的一步，不僅要盡可能地將環境中所有微生物的DNA提取出來，而且還要保證一定的DN段長度和完整性。根據提取樣品總DNA前是否需要分離細胞，可將其提取方法分為原位裂解法和異位裂解法。原位裂解法可直接破碎樣品中的微生物細胞而使其DNA得以釋放。原位裂解法無需對樣品微生物進行復蘇，黏附顆粒上的微生物細胞亦能被裂解，所得DNA能更好地代表微生物的多樣性。由于原位裂解法所提取的DN段僅為1～50kb，故其通常用于構建小片段插入文庫（以質粒或入噬菌體為載體）的DNA提取。異位裂解法則先采用物理方法將微生物從樣品中分離出來，然后以較溫和的方法抽提其DNA。此法提取可以獲得長度為20～500kb的大片段DNA，而且純度高，但卻容易丟失微生物物種信息。該方法適用于構建大片段插入文庫（以黏粒或細菌人工載體為載體）的DNA提取。

1.1.2載體選擇　目的基因能否有效地轉入宿主細胞并在其中高表達，在很大程度上取決于載體。通常用于DNA克隆的載體包括質粒、黏粒和細菌人工染色體（bacterial　artificial　chromosome，BAC）等。質粒一般用于克隆小于10kb的DN段，適用于單基因的克隆與表達。黏粒又稱柯斯質粒或柯斯載體，用于克隆大片段的DNA分子，其克隆外源DN段的極限高達350kb，遠遠超過質粒載體的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DN段，最多可保存300kb個堿基對，轉化率高，而且其以環狀結構存在于細菌體內，易于分辨和分離純化。另外，構建能容納40kb外源DNA插入片段的fosmid文庫也有報道。

1.1.3宿主選擇　目前，常用的宿主主要有大腸埃希菌以及鏈霉菌屬或假單胞菌屬。一些缺陷型突變體細菌也可以作為宿主進行宏基因組文庫的功能篩選。宿主的選擇主要應考慮其轉化率和宏基因表達以及重組載體在宿主細胞中的穩定性和目標性狀的篩選等。對于任何宏基因組來源的基因來說，大腸埃希菌依然是最理想的克隆和表達宿主。也可以用其他宿主菌，例如被用來鑒定與新抗生素生物合成相關基因的淺青紫鏈霉菌和一些革蘭陰性細菌。也可以用穿梭黏粒或BAC載體將構建于大腸埃希菌的文庫轉入其他宿主，如鏈霉菌屬或假單胞菌屬中。根據不同微生物產生活性物質的差異和研究目標的不同，選擇不同的宿主。隨著技術的成熟和新宿主的選擇，基因篩選率和功能基因檢測率得以提高，進而宏基因組文庫的目標基因的表達也得以提高。

1.2宏基因組文庫的篩選

根據研究目的，宏基因組文庫的篩選通常有功能篩選和序列篩選兩種方法。功能篩選最常用方法是根據重組克隆產生一些酶蛋白功能活性，采用各種檢測手段，挑選活性克隆子，得到完整的功能基因和帶有目的基因的基因簇，發現全新的基因或活性物質。功能篩選首先要求功能基因或帶有目的的基因簇在宿主中表達，但因其受到檢測手段的限制，往往是在數千個甚至數百萬個重組克隆子中才能檢測到有用的活性克隆。序列篩選是依賴于目的基因的保守DNA序列，以序列相似性為基礎，執行某類功能的酶可能具有相似的基因序列，根據已有的序列信息設計引物，進行PCR擴增或雜交篩選陽性克隆子。序列篩選一般只能獲得結構基因的片段，而不能獲得完整的功能基因；但是，它可以將擴增產物進行標志并將其作為探針篩選宏基因文庫，以獲得完整的功能基因。用這種方法有可能篩選到某一類結構或功能的蛋白質中的新分子。

宏基因組文庫的篩選除了功能篩選和序列篩選法外，還可以采用底物誘導基因表達法（sub-strate-induced　gene　expression，SIGEX）。SIGEX是以代謝相關基因或酶基因往往有底物存在的條件下才表達，反之則不表達的原理來篩選目的代謝基因的。SIGEX的優點在于它為高通量篩選提供了保障，而且不需要對底物進行修飾。

2　宏基因組學在口腔微生物研究領域中的應用

2.1口腔微生物群落結構分析

口腔是一個由大量微生物組成的復雜的生態系統，人類口腔中寄居著大約700多種細菌。人類口腔適宜的溫度、濕度，豐富的營養來源，結構的復雜性和理化性質的不同，為口腔內各種微生物的生長、繁殖和定居提供了非常適宜的環境，因而也就造就了口腔微生物群的多樣性。口腔微生物大部分可以相互關聯并形成生物膜，抵抗機械清除力或抗生素治療，但是在環境變化或其他口腔情況（如個人口腔衛生質量）變化觸發時，它們也可成為致病微生物。

菌斑指示劑和傳統培養方法以及常規的PCR特異性擴增的分子生物學方法在某種程度上都不能完整地反映整個微生物群落的組成和動態變化，不適合用其研究復雜的口腔微生物群落。此外，在難培養或不可培養的微生物當中，可能也有致病菌匿藏其中，因而也不能有效地用其研究與病程相關的微生物。

隨著分子生物學和分子遺傳學技術的發展，在基因組學的基礎上誕生了宏基因組學這一門嶄新的交叉學科。宏基因組學是繼發明顯微鏡以來研究微生物最重要的進展，將為微生物世界帶來革命性的突破。Turnbaugh等利用16S　rRNA基因測序發現：胖人和瘦人的內臟中有著不同的微生物菌群；當胖人減肥的時候，他們內臟中的細菌群基因也同樣發生變化，更加接近瘦人內臟中的細菌群。

基于常規的口腔細菌培養方法和細胞學顯微鏡檢查，目前公認變異鏈球菌和乳酸桿菌等是引起齲病的主要致病菌；但是，隨著宏基因組學在微生物的種類和多樣性研究中的應用，有關齲病是由單一細菌引起或是由生物膜中的多種細菌引起的定論面臨質疑。目前普遍認為，齲病并不是僅由變異鏈球菌或其他任何一種菌斑中的細菌單獨引起的，而是由各種產酸菌相互作用的結果。

Aas等在對51名齲患者的1285個菌斑細菌的16S　rRNA序列進行分析后發現，50％的細菌不能識別，一些新的細菌菌種與齲病的發生有關。Keijser等在用焦磷酸測序法分析健康人涎液和牙菌斑中細菌群時發現，口腔微生物具有多樣性。即他們從98名健康成人口腔中取得的牙菌斑就由1萬個微生物表型組成，其種族數遠遠超過之前報道的通過培養或者傳統克隆和測序技術定義的700種口腔微生物表型。

Zaura等在利用焦磷酸測序技術檢測了3名健康高加索人口腔內5個部位的微生物組后發現，在健康人的口腔中微生物有3600種獨特物序列，超過500種不同的分類單元或“物種級”表型和88～104種高級分類群，每個單獨的樣品平均藏匿有266種分類單元。從這3名個體微生物組的測序結果分析可知，高級分類群、分類單元和獨特序列都有一個較大的重疊，即84％的高級分類群、75％的分類單元和65％的獨特序列至少在這3個微生物組中的2個組中存在。這3名個體的總共6315個獨特序列中有1660個相同序列，這1660個相同序列，即“核心微生物組”貢獻了66％的測序內容，重疊的分類單元貢獻了94％的內容，而幾乎所有的內容（99.8％）都屬于共享的高級分類群。

研究證實，在不同的健康人的口腔微生物中，大部分微生物組是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物組。Kanasi等在對80名患齲和無齲嬰幼兒牙菌斑微生物的16S　rRNA序列克隆分析中發現，兩者之間存在著139種不同微生物。Gross等通過酶促法測序技術對無齲和患齲年輕恒牙牙菌斑微生物的16S　rRNA序列進行分析后認為，齲齒中產酸菌除了變異鏈球菌和乳酸桿菌外，月形單胞菌、奈瑟菌和緩癥鏈球菌同樣是潛在的產酸細菌。Willner等等在利用高通量測序技術檢測了19名健康人口腔咽部的病毒宏基因組序列后發現，口腔咽部是一個潛在的被噬菌體T3侵蝕的腸道菌儲存庫。另外，他們還發現了編碼血小板凝集因子PblA和PblB的兩個寄生于變異鏈球菌中的噬菌體sm-1基因，而之前有研究稱在心內膜上發現了變異鏈球菌。這說明，口腔中的病毒與心臟疾病存在潛在的聯系。

宏基因組學技術可以避開傳統的培養方法，在DNA水平來探討口腔微生物群落結構及其與環境微生物的關系。微生物多樣性在基因水平上主要表現為基因組大小和基因數目的多樣性，遺傳物質化學組成的多樣性和某些特異性序列的差異。宏基因組技術為研究口腔微生物復雜群落和多樣性提供了重要的技術手段，通過快速可靠地獲得口腔微生物中各種微生物的菌落指紋和特征性核苷酸序列，以系統分析口腔微生物的多樣性及其分類地位，發掘豐富的口腔微生物資源。

2.2口腔微生物宏基因組文庫中的新型基因篩選及其功能

宏基因組學除了研究微生物群落結構及其功能外，還可用于發現新的基因和開發新的微生物活性物質。Jiang等構建土壤宏基因文庫，成功地克隆和鑒定出一種新型的β-葡萄糖苷酶基因，該基因包含一個由151個氨基酸編碼組成的多肽。該研究對深入挖掘土壤未培養微生物的β-葡萄糖苷酶基因資源和該基因功能具有的重要意義。陳春嵐等從富集培養物宏基因組文庫中篩選出一個表達木聚糖酶基因umxyn10B，該基因大小為999bp，編碼產物的氨基酸序列具有較好的同源性。對其功能進行研究發現，該酶具有優良的理化特性，可廣泛應用于食品、能源、造紙和紡織等行業。Yu等利用宏基因功能篩選發現的兩個新型低溫活性酶脂EstM-N1和EstM-N2，屬于細菌脂肪分解酶Ⅷ家族成員。這一發現將推動生物催化劑的應用。

當前，宏基因組學技術已經在微生物學研究的諸多領域，尤其是在發現具有潛在應用價值的次生代謝產物方面顯示出了無窮的魅力，但是，利用宏基因組技術探索口腔微生物的新的功能基因尚處于起步階段。Warburton等對口腔細菌群體中的耐藥基因進行了分析，結果發現一個新的耐四環素基因tet32能夠使四環素失活。雖然對口腔微生物新的功能基因及其功能研究還太少，但依然可以借助宏基因組學技術發掘新基因，以利用這些新基因在口腔醫學行業發揮應有的作用。